富硒綠茶對大鼠非酒精性脂肪肝Ca2+-ATPase活性和表達(dá)的影響

王鳳杰，陳顯兵,*，張書毓，譚志鑫，向國敏，劉錦紅

（1.湖北民族學(xué)院 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院科技學(xué)院，湖北 恩施 445000）

富硒綠茶對大鼠非酒精性脂肪肝Ca2+-ATPase活性和表達(dá)的影響

王鳳杰1,2，陳顯兵1,2,*，張書毓2，譚志鑫2，向國敏2，劉錦紅2

（1.湖北民族學(xué)院 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院科技學(xué)院，湖北 恩施 445000）

目的：研究恩施富硒綠茶對大鼠非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）中肝臟肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATPase（sarco（endo）plasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）活性及其表達(dá)的影響，探討富硒綠茶防治NAFLD的可能作用機(jī)制。方法：將32 只Wistar大鼠分成4 組，分別飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料+常規(guī)飲水（NC組）、高脂飼料+常規(guī)飲水（HC組）、高脂飼料+普通綠茶（TC組）、高脂飼料+富硒綠茶（SeC組）。9 周后處死，觀察大鼠一般情況，測定肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平、肝臟組織ATPase活性；采用免疫組化染色和Western blotting檢測肝臟內(nèi)總SERCA蛋白表達(dá)，觀察各指標(biāo)變化情況。結(jié)果：HC組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量明顯增高，Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性降低，SERCA蛋白表達(dá)降低；富硒綠茶干預(yù)后Ca2+含量降低，酶活性升高，表達(dá)增加，較普通綠茶效果明顯。結(jié)論：富硒綠茶對高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪肝病具有干預(yù)作用，可能是通過降低肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+和TNF-α含量而改善肝臟能量代謝障礙，同時(shí)提高了SERCA活性，增強(qiáng)其蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

富硒綠茶；非酒精性脂肪肝??；肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATPase

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已愈來愈成為全球關(guān)注的健康問題，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能異常導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）和脂質(zhì)代謝障礙是研究熱點(diǎn)之一。Ca2+廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等部位，在細(xì)胞分化、凋亡、免疫等多方面發(fā)揮重要作用[1]，肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATPase（sarco（endo）plasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）是ATP依賴性的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)酶，主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌漿網(wǎng)膜上。細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激可以破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，啟動Ca從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca池的釋放，增加活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而放大氧化應(yīng)激及Ca負(fù)載，引起惡性循環(huán)。前期研究已證實(shí)NAFLD大鼠肝臟內(nèi)抗氧化酶活性降低，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，提示氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可能參與了NAFLD的發(fā)生[2]，而且富硒綠茶具有降低脂肪肝形成、清除自由基、提高抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等功效[2-3]。那么富硒綠茶在預(yù)防和治療NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中的機(jī)制是怎樣的呢？本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD大鼠模型，觀察富硒綠茶干預(yù)后脂肪肝的氧化性損傷及SERCA活性及表達(dá)情況，探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

Wistar大鼠32 只，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供（生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2008-0005；使用許可證號：SYXK（鄂）2008-0014），雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g。

富硒綠茶為恩施富硒區(qū)宣恩伍家臺貢茶，采用示波極譜法檢測出富硒綠茶的硒含量為3.235 8 μg/g，武漢某普通綠茶硒含量為0.428 57 μg/g。飼料由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，高脂飼料配方如下（以下均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：標(biāo)準(zhǔn)飼料80%，豬油10%，蛋黃粉10%[4]。

膽固醇 武漢化學(xué)試劑公司；ATPase測定試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫試劑盒 南京建成生物工程研究所；SERCA抗體 美國Santa Cruz公司；內(nèi)參β-actin（1∶2 000）美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5418型離心機(jī) 德國Eppendorf公司；UV-5300紫外-可見分光光度計(jì) 西安德派生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及模型建立

Wistar大鼠32 只，常規(guī)喂養(yǎng)1 周后分為4 組，每組8 只。正常對照組（NC組）、高脂模型組（HC組）、普通綠茶組（TC組）及富硒綠茶組（SeC組）；NC組喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，HC、TC及SeC組喂高脂飼料，均自由飲水，在此基礎(chǔ)上，NC和HC 2 組均用蒸餾水（3 mL/d）灌胃作為對照；2 種綠茶分別加沸蒸餾水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%茶溶液，TC組用普通綠茶溶液灌胃（1.5 g/（kg·d）），SeC組灌胃富硒綠茶溶液（1.5 g/（kg·d））。按上述要求持續(xù)喂養(yǎng)9 周后處死，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

1.3.2 觀察指標(biāo)及測定分析方法

1.3.2.1 肝臟組織病理學(xué)檢測

取肝臟組織用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察肝臟脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤及纖維化程度。

免疫組化染色：采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化法（immunohistochemistry，IHC）檢測，二氨基聯(lián)苯胺顯色，一抗SERCA的工作濃度為1∶800，操作流程按試劑說明書進(jìn)行。

Western blotting檢測肝臟組織內(nèi)SERCA1/2/3蛋白的表達(dá)：取-80 ℃保存的肝臟組織加入到10 倍體積pH 7.4的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，用電動勻漿器制備肝勻漿，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min后，取上清液進(jìn)行蛋白定量后檢測。圖像掃描和分析采用美國UVP公司凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件。

1.3.2.2 肝細(xì)胞中Ca2+含量的測定

采用火焰原子吸收法測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量[5]。

1.3.2.3 肝臟組織TNF-α水平測定

采用酶聯(lián)免疫法按照試劑盒說明測定肝勻漿中TNF-α含量。

1.3.2.4 肝臟組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性測定

采用定磷法測定，按試劑盒說明書操作。ATPase活性以每小時(shí)每毫克組織蛋白中ATPase分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量作為一個(gè)ATPase活力單位/（μmol/（mg·h））。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織病理學(xué)改變

2.1.1 常規(guī)HE染色

參照前期研究結(jié)果[2]，證實(shí)HC組大鼠肝質(zhì)量及肝指數(shù)最大，肝小葉內(nèi)可見明顯的大泡樣脂肪變性，彌漫分布，另見少量炎細(xì)胞浸潤，脂肪變性程度顯著強(qiáng)于其他組，說明造模成功。

2.1.2 免疫組化染色

圖1 大鼠肝臟中SERCA1/2/3蛋白定位表達(dá)（IHC，×400）Fig.1 Expression of SERCA1/2/3 in liver (IHC, ×400)

喂養(yǎng)結(jié)束后取各組大鼠部分肝臟組織做免疫組化染色，檢測肝臟內(nèi)SERCA蛋白表達(dá)情況。如圖1所示，SERCA蛋白表達(dá)主要位于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，NC組SERCA蛋白呈棕黃色細(xì)顆粒狀，均勻分布；HC組陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，著色強(qiáng)度減弱，且胞漿內(nèi)可見脂肪空泡；TC組肝小葉中央靜脈周圍可見少量陽性細(xì)胞；而經(jīng)富硒綠茶干預(yù)后的SeC組肝細(xì)胞內(nèi)可見棕黃色陽性細(xì)胞量增多，彌漫分布，染色強(qiáng)度亦增加，說明蛋白表達(dá)增強(qiáng)。

2.1.3 Western blotting檢測蛋白表達(dá)情況

圖2 肝臟SERCA1/2/3蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of SERCA1/2/3 in liver

由圖2可知，各組大鼠肝臟內(nèi)均可見SERCA蛋白表達(dá)，但蛋白條帶灰度值有差異，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次以上結(jié)果做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（圖2b），HC組大鼠肝臟內(nèi)蛋白量極顯著低于NC組（P＜0.01）；SeC組較HC組蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；而TC組與HC組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明飲用普通綠茶水在增加肝臟組織SERCA蛋白表達(dá)量上無明顯作用。

2.2 肝臟內(nèi)Ca2+、TNF-α含量變化

表1 肝臟內(nèi)Ca2+、TNF- 含量變化（x ＝8）Table1 Ca2+ and TNF- levels in liver (x , = 8)

由表1可知，與NC組相比，HC組肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量明顯升高，而TC組和SeC組經(jīng)干預(yù)后Ca2+含量均降低，差異顯著（P＜0.05），SeC組作用更明顯（P＜0.05）；HC組肝臟組織內(nèi)TNF-α水平明顯高于NC組，富硒綠茶干預(yù)后其含量降低，效果優(yōu)于TC組（P＜0.05）。說明富硒綠茶在降低肝臟內(nèi)Ca2+含量及改善肝損傷方面較普通綠茶效果更明顯。

2.3 肝臟組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性的變化

表2 肝臟組織內(nèi)Na -K -ATPase、Ca2+-ATPase活性變化（x ＝8）Table2 Activities of Na -K -ATPase and Ca2+-ATPase in liver (x , = 8)

由表2可知，HC組大鼠肝臟Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性下降，富硒綠茶干預(yù)后，SeC組2 種酶活性均明顯升高，差異極顯著（P＜0.05）；而且與普通綠茶相比，富硒綠茶更能提高Ca2+-ATPase活性（P＜0.05）。

3 討 論

NAFLD目前已成為導(dǎo)致無癥狀性轉(zhuǎn)氨酶升高的首要病因[6]，后期可進(jìn)展為肝硬化。外源性高脂飲食使血清游離脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）增加，肝臟對NEFA攝取的增加使線粒體β氧化速度代償性增加，進(jìn)而增加反應(yīng)性氧產(chǎn)物的產(chǎn)出，反應(yīng)性氧產(chǎn)物與膜磷脂的不飽和脂肪酸反應(yīng)形成脂質(zhì)過氧化，而且隨著脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的加劇，肝細(xì)胞形態(tài)和功能的損傷程度加重[7]，當(dāng)活性氧化的產(chǎn)生超過體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的清除能力時(shí)，便產(chǎn)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷，使枯否細(xì)胞激活并釋放腫瘤壞死因子等炎性細(xì)胞因子和遞質(zhì)，引起脂肪性肝炎甚至肝硬化[8-9]。本課題組前期通過高脂飲食已經(jīng)成功誘導(dǎo)出NAFLD模型，模型組大鼠體質(zhì)量及肝臟質(zhì)量明顯增加，血脂及肝臟脂肪化程度均明顯增高，富硒綠茶干預(yù)后能有效降低高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠肝臟脂肪變性程度[2]，亦證實(shí)氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化與NAFLD的發(fā)病存在某種聯(lián)系，這與國內(nèi)外某些文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。

線粒體功能明顯異常，既是NAFLD的結(jié)果也是導(dǎo)致進(jìn)一步損傷的重要環(huán)節(jié)[11]。脂肪肝病時(shí)由于ATP生成減少，Na+-K+-ATPase活性降低可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[12]。Ca2+-ATPase是維持細(xì)胞內(nèi)Ca平衡的重要物質(zhì)，其活性下降使線粒體Ca泵向細(xì)胞外排Ca作用減弱，線粒體內(nèi)Ca超載是線粒體氧化磷酸化障礙、結(jié)構(gòu)受損和細(xì)胞壞死的重要原因[13]。SERCA能夠逆濃度梯度將細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中從而降低細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度，這對于Ca信號和細(xì)胞增殖具有重要的作用[14]。SERCA有3 種亞型，不同組織和種屬存在不同亞型，大鼠肝臟表達(dá)SERCA 2b和SERCA 3兩種亞型[15-16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NAFLD大鼠肝臟組織中Ca2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性及蛋白表達(dá)均顯著下降，Ca含量明顯升高，出現(xiàn)Ca超載現(xiàn)象，這可能與氧自由基產(chǎn)生增加，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化，使膜通透性改變，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，同時(shí)細(xì)胞Ca2+-ATPase失活，胞內(nèi)Ca外流障礙，Na+-K+-ATPase失活，胞內(nèi)Na+含量增加，刺激Na+-Ca2+交換，使Ca2+內(nèi)流增加，加劇了Ca超載。富硒綠茶干預(yù)可以明顯提高NAFLD大鼠肝臟組織中谷胱甘肽過氧化物酶[2]、Ca2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性，增強(qiáng)總SERCA蛋白表達(dá)，有效阻抑丙二醛[2]和Ca2+含量的升高。另外，發(fā)生脂肪肝時(shí)肝臟內(nèi)TNF-α水平明顯增高，提示可能存在肝損傷及炎癥反應(yīng)，通過肝臟組織病理學(xué)檢查也證明存在炎癥及肝細(xì)胞壞死；也有研究表明TNF-α可以通過增強(qiáng)自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化等方面促進(jìn)脂肪性肝炎的發(fā)生[17-18]，富硒綠茶干預(yù)后TNF-α水平降低，且比普通綠茶效果更加明顯。富硒綠茶保護(hù)肝損傷的機(jī)制可能是茶多酚增強(qiáng)脂肪肝大鼠自由基代謝作用，對ATPase活性下降和組織Ca超載有阻抑作用。因?yàn)樘烊豢寡趸瘎┎瓒喾邮菑牟枞~中提取的一種多酚類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)中富含酚羥基，可提供活潑氫使自由基滅活，而本身被氧化形成的自由基由于含鄰苯二酚結(jié)構(gòu)而具有較高穩(wěn)定性，具有抗氧化、保護(hù)生物膜及調(diào)節(jié)組織Ca2+含量等廣泛的生物學(xué)作用，研究證實(shí)其抗氧化效果比VE、VC高出20 倍[19]；也可能是硒作用所致，王玉珍等[20]認(rèn)為硒可以增加細(xì)胞膜、肌漿網(wǎng)Ca泵的活性，防止細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載；缺硒也可能通過過氧化損傷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載[21]。由此推測富硒綠茶可能是通過降低脂肪肝病大鼠肝臟內(nèi)Ca2+含量、維持細(xì)胞內(nèi)Ca穩(wěn)態(tài)、降低肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)、提高Ca2+-ATPase活性、增強(qiáng)肝臟總SERCA表達(dá)，進(jìn)而改善大鼠肝臟能量代謝障礙，達(dá)到干預(yù)NAFLD發(fā)生發(fā)展的目的。

SERCA表達(dá)情況還和細(xì)胞的種類、生長狀態(tài)等均有關(guān)，而且SERCA的活性不僅和表達(dá)量有關(guān)，還受機(jī)體代謝等方面的影響。那么在NAFLD中氧自由基的堆積、Ca2+超載與SERCA表達(dá)之間的關(guān)系及有無相互作用，以及調(diào)控機(jī)制如何，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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Effect of Selenium-Enriched Green Tea on Activity and Expression of Sarco(endo)Plasmic Reticulum Ca2+-ATPase
(SERCA) in Rats with Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD)

WANG Feng-jie1,2, CHEN Xian-bing1,2,*, ZHANG Shu-yu2, TAN Zhi-xin2, XIANG Guo-min2, LIU Jin-hong2
(1. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China; 2. Science and Technology College of Hubei Minzu University, Enshi 445000, China)

Objective: To investigate the effect of selenium-enriched green tea on the activity and expression of sarco(endo) plasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) on model rats with experimental non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and explore the possible mechanisms for the prevention and treatment of NAFLD. Methods: Totally 32 Wistar rats were divided into 4 groups randomly and fed with standard diet and water (NC), high-fat diet and water (HC), high-fat diet and tea (TC), high-fat diet and selenium-enriched tea (SeC), respectively. After 9 weeks, the rats were killed to investigate the changes in Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase activities. Meanwhile, hepatic tumor necrosis factor-α (TNF-α) and Ca2+levels and the protein expression of SERCA in hepatocytes was evaluated by immunohistochemistry (IHC) and Western blotting. Results: The protein expression of SERCA and the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were significantly decreased and the Ca2+level was remarkably increased in HC group. The activity and expression of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in liver were markedly upregulated in intervention group. On the contrary, the level of Ca2+in SeC group was greatly reduced when compared with ordinary tea. Conclusion: Selenium-enriched green tea can improve hepatic energy metabolism disorder, protect liver function, and prevent liver damage in NAFLD rats.

selenium-enriched green tea; nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD); sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)

R285.5

A

1002-6630（2014）21-0219-04

10.7506/spkx1002-6630-201421043

2014-01-22

生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（PKLHB1308）；湖北民族學(xué)院科技學(xué)院科研項(xiàng)目（KY201410）

王鳳杰（1981—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⒘吭嘏c健康。E-mail：625958220@qq.com

*通信作者：陳顯兵（1976—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槲⒘吭嘏c健康。E-mail：chenxianbing7612@163.com