湖南茯磚茶香氣成分的SPME-GC-TOF-MS分析

顏鴻飛，王美玲，白秀芝，朱紹華，戴 華，李擁軍,*

（1.湖南出入境檢驗檢疫局，湖南 長沙 410004；2.國家食品安全檢測重點實驗室，湖南 長沙 410004）

湖南茯磚茶香氣成分的SPME-GC-TOF-MS分析

顏鴻飛1,2，王美玲1,2，白秀芝2，朱紹華1,2，戴 華1，李擁軍1,2,*

（1.湖南出入境檢驗檢疫局，湖南 長沙 410004；2.國家食品安全檢測重點實驗室，湖南 長沙 410004）

采用單因素對比試驗方法確定固相微萃取湖南茯磚茶中香氣成分的優(yōu)化條件，并結(jié)合氣相色譜-飛行時間-質(zhì)譜法鑒定湖南茯磚茶香氣組分。結(jié)果表明：固相微萃取與氣相色譜-飛行時間-質(zhì)譜聯(lián)用分析湖南茯磚茶香氣成分的最佳條件為DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm）、萃取溫度80 ℃和萃取時間60 min。氣相色譜-飛行時間-質(zhì)譜法從3 個茯磚茶中共分離鑒定出93 種香氣成分，占檢出揮發(fā)性成分總量的90%以上，主要由酮類、醛類、碳氫類、雜氧類、醇類、酸類、酯類、含氮類8 類化合物構(gòu)成。在鑒定出的香氣化合物中共有香氣組分50 個，其中含量較高的組分有反,反-2,4-庚二烯醛、甲基庚烯酮、2-戊基呋喃、香葉基丙酮、3,5-辛二烯-2-酮（E,E）、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮等。

固相微萃?。粴庀嗌V-飛行時間-質(zhì)譜法；湖南茯磚茶；香氣成分

傳統(tǒng)的湖南黑茶是采用湖南雪峰山脈茶區(qū)的大中葉群體品種鮮葉，經(jīng)過殺青、揉捻、渥堆、松柴明火干燥四大工藝加工而成的毛茶和以其為原料蒸壓成形的緊壓茶總稱[1]。湖南黑茶始于安化，安化黑茶中的茯茶制作技藝已列入國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。茯磚茶是湖南安化黑茶代表性產(chǎn)品之一，渥堆發(fā)酵過程中，由于冠突散囊菌等微生物的大量介入，形成孢外酶，在孢外酶促作用和茶葉本身濕熱作用的協(xié)同下，形成湖南安化茯磚茶典型獨特的“菌花香”香氣品質(zhì)[2-8]。

茶葉的香氣成分主要是揮發(fā)性與半揮發(fā)性化合物，含量低，且復雜不穩(wěn)定，其分析結(jié)果的準確性很大程度上取決于香氣物質(zhì)的萃取方式。常用的茶葉香氣提取方法有水蒸氣蒸餾法[9]、同時蒸餾-萃取法[10]、頂空吸附法[11]、超臨界流體萃取法[12]、吹掃捕集法[13]以及固相微萃取等[14]。固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）法是20世紀90年代出現(xiàn)的一種集采集、萃取、濃縮、進樣于一體的樣品前處理技術(shù)，并可直接與氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜等儀器聯(lián)用實現(xiàn)在線分析。近些年來，SPME法由于其表征香氣品質(zhì)高可信度的優(yōu)點，日漸成為茶葉香氣成分研究的重要方法[15-21]。但檢索發(fā)現(xiàn)運用SPME技術(shù)分析湖南黑茶香氣物質(zhì)的研究鮮見報道。本實驗擬通過對SPME萃取參數(shù)的優(yōu)化，采用自動頂空SPME技術(shù)對湖南茯磚茶香氣成分進行捕集，并結(jié)合氣相色譜-飛行時間-質(zhì)譜（gas chromatography-time of flight-mass spectrometry，GC-TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)快速分析湖南茯磚茶香氣成分，旨在為湖南茯磚茶的質(zhì)量控制、品質(zhì)量化及原產(chǎn)地保護提供一種科學的技術(shù)手段。

1 材料與方法

黑茶樣品1號為湖南省益陽市益陽茶廠的金湘益茯磚、2號為湖南省安化縣安化茶廠的金花茯磚、3號為湖南省桃江縣湘豐浩茗茶業(yè)有限公司的特制茯磚。

100 ?m聚二甲基硅氧烷涂層纖維（polydimethylsiloxane，PDMS）、30/50 ?m二乙烯涂層纖維-碳分子篩-聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/PDMS，DVB/CAR/PDMS）、75?m碳分子篩聚二甲基硅氧烷涂層纖維（CAR/PDMS） 美國Supelco公司。

1.2 儀器與設備

LECO氣相色譜-飛行時間-質(zhì)譜儀（配有電子電離源及PEGAS 4.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國LECO公司；Combi PAL全自動SPME進樣系統(tǒng) 瑞士CTC公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME萃取

固相微萃取使用前先將萃取頭在GC進樣口280 ℃活化1 h。稱取2.0 g（精確至0.001g）粉碎均勻茶樣，放入20 mL SPME萃取瓶中，封口。將其置于預先設置好溫度的SPME萃取自動進樣系統(tǒng)進行分析。SPME自動進樣系統(tǒng)條件：恒溫80 ℃振蕩20 min，使茶葉香氣充分揮發(fā)和平衡，插入固相微萃取針，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為600 r/min條件下，80 ℃萃取60 min，完成萃取后，迅速插入GC進樣口，進樣口溫度250 ℃，解吸5 min，進行GC-TOF-MS測定。

《政府會計制度》要求高等學校會計核算應當具備財務會計與預算會計雙重功能，對于納入部門預算管理的現(xiàn)金收支業(yè)務，在用財務會計核算的同時應當進行預算會計核算；對于其他業(yè)務，僅需進行財務會計核算。同時要求高等學校對基本建設投資應當按照《政府會計制度》的規(guī)定統(tǒng)一進行會計核算，不再單獨建賬，但是應當按項目單獨核算，并保證項目資料完整。

1.3.2 GC條件

色譜柱：Rtx-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）；升溫程序：50 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至210 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；進樣溫度250 ℃；載氣（He）流速1.2 mL/min；進樣模式：分流，分流比10∶1。

1.3.3 TOF-MS條件

電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度270 ℃；離子源溫度230 ℃；離子采集方式：一維全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～400；采集頻率20張/s；檢測器電壓1 700 V；溶劑延遲時間5 min。

1.3.4 單因素優(yōu)化試驗設計

采用單因素逐步優(yōu)化的方法，根據(jù)不同條件下色譜峰的總面積和出峰數(shù)目共同確定最佳的萃取頭類型、萃取溫度和萃取時間。

表1 SPME萃取參數(shù)單因素優(yōu)化試驗設計Table 1 SPME extraction parameters used in single factor design optimization

1.4 定性定量分析

定性分析：香氣化合物成分的定性采用NIST 11譜庫進行檢索匹配，僅報道相似指數(shù)（similarity index，SI）大于800的化合物，部分化合物結(jié)合人工解析質(zhì)譜圖并參照已發(fā)表的相關(guān)文獻進行確證。定量分析：采用峰面積歸一化法進行定量，求得各揮發(fā)性成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取頭的選擇

3 種不同類型萃取頭的比對結(jié)果表明，萃取揮發(fā)性成分物質(zhì)總量最多的是30/50 ?m（DVB/CAR/ PDMS），75 ?m（CAR/PDMS）次之，100 ?m（PDMS）最少，其萃取物質(zhì)總量之比依次為142.7∶131.1∶6.8。30/50、75、100 ?m 3 種萃取頭萃取揮發(fā)性成分數(shù)目分別為87、77、32 種。3 種萃取頭中，30/50 ?m（DVB/CAR/PDMS）對揮發(fā)性低沸點和高沸點風味成分的萃取能力都較強，萃取成分沸點分布范圍更寬，更能反映茶葉香氣的整體特征，因而選擇30/50 ?m DVB/CAR/PDMS萃取頭。

2.1.2 萃取溫度的選擇

萃取溫度是影響SPME萃取效率的一個重要因素。一方面，升高溫度有助于分析物脫離基體加快向涂層靠攏而被吸附，縮短萃取平衡時間。另一方面，溫度升高，會導致分配系數(shù)K降低，影響萃取靈敏度。結(jié)果顯示（圖1），隨著水浴溫度的升高，總峰面積呈持續(xù)上升態(tài) 勢，而總峰個數(shù)的增速在80 ℃后趨于平緩。值得一提的是，萃取溫度高于80 ℃時總峰面積的增加主要集中在咖啡因和N-乙基琥珀酰亞胺2 種高沸點物質(zhì)的貢獻上，并沒有體現(xiàn)在產(chǎn)生新化合物的貢獻上。低于80 ℃時低沸點物質(zhì)較多，高沸點物質(zhì)很少，總峰面積和總峰個數(shù)也較少。80 ℃時萃取物質(zhì)范圍較廣，低沸點和中高沸點組分分布比較均衡，主要茶葉特征香氣成分相對含量較適中，克服了較低萃取溫度和較高萃取溫度所帶來的問題，所以萃取溫度選為80 ℃。

圖1 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.1 Effect of adsorption temperature on extraction efficiency

2.1.3 萃取時間的選擇

SPME技術(shù)的萃取過程是一個平衡分配過程，萃取時間由待分析物與涂層之間的吸附快慢來決定的。在未達到吸附平衡前，涂層萃取量隨時間變化而改變，直至達到萃取平衡。如圖2所示，隨著吸附時間的延長，總峰面積略有增加，無明顯變化。在萃取時間20～60 min內(nèi)，總峰個數(shù)顯著增加，60 min后增加趨于平緩，吸附-解吸動態(tài)平衡達到最佳狀態(tài)。因此，60 min為最佳萃取時間。

圖2 萃取時間對萃取效果的影響Fig.2 Effect of adsorption time on extraction efficiency

2.2 湖南茯磚茶主要香氣化合物成分分析

圖3 3 個茯磚茶主要香氣化合物類型的相對含量Fig.3 Relative contents of major chemical classes of aroma compounds in 3 kinds of Fuzhuan tea

在優(yōu)化的SPME條件下，萃取得到的茯磚茶香氣化合物經(jīng)GC-TOF-MS檢測，共鑒定出93 種揮發(fā)性組分，分別占揮發(fā)性化合物總量的92.661%、90.84 1%和93.919%（表2）。由圖3可知，從香氣成分種類及數(shù)量分析，碳氫類化合物有34 種，其次是醛類有20 種，酮類有17 種。檢出的化合物中脂肪族醛、酮類化合物、萜烯類化合物以及芳香醇等構(gòu)成茯磚茶基本香氣，同時表現(xiàn)出較強火功香的雜環(huán)化合 物對茯磚茶的特征香型可能給以協(xié)調(diào)作用。

圖4 茯磚茶樣1號（A）、2號（B）、3號（C）香氣成分總離子流色譜圖Fig.4 Total ion current chromatograms of aroma constituents from 3 kinds of Fuzhuan teas

由圖3可知，3 種茯磚茶中共有組分有50 個，分別占各自檢出揮發(fā)性成分數(shù)量總數(shù)的65.79%、66.67%和71.40%；共有組分相對含量占各自檢出揮發(fā)性成分總量的83.691%、81.802%和87.517%，是湖南茯磚茶揮發(fā)性成分的主體成分，其總離子流圖見圖4。從表2可知，3 種茯磚茶中相對含量較高的共有組分有反,反-2,4-庚二烯醛、甲基庚烯酮、2-戊基呋喃、香葉基丙酮、3,5-辛二烯-2-酮（E,E）、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮等。其中反,反-2,4-庚二烯醛、3,5-辛二烯-2-酮（E,E）、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮等烯醛、烯酮類化合物對茯磚茶的“菌花香”有重要貢獻。同時，在GC-TOF-MS檢測中還發(fā)現(xiàn)了一些重要的香氣化合物，如香葉基丙酮，具有花香及木香，對茯磚茶獨特香型有特殊貢獻；α-紫羅酮、β-紫羅酮等紫羅酮類化合物是由茶葉中類胡蘿卜素先質(zhì)降解產(chǎn)生的一類重要的香氣特征化合物；2-戊基呋喃等呋喃類化合物具有較高的香氣強度和較低的閾值，賦予茯磚茶的烘焙香或火功香；藜蘆醚、1,2,3-三甲氧基苯等甲氧基苯類化合物在茯磚茶中有檢出。它們共同構(gòu)成了湖南茯磚茶主要的香氣特征化合物。

表2 湖南茯磚茶中主要揮發(fā)性香氣成分（n=3）Table 2 Aroma components identified in Hunan Fuzhuantea (n= 3)

續(xù)表2

3 討 論

本實驗通過對SPME的影響因素萃取頭類型、萃取溫度、萃取時間等進行優(yōu)化（以鑒定出的色譜峰個數(shù)和總峰面積評估），建立湖南茯磚茶中香氣成分的SPMEGC-TOF-MS分析方法，共鑒定出湖南茯磚茶香氣成分93 種，以酮類、醛類、碳氫類、雜氧類、醇類、酸類、酯類和含氮類化合物為主。其中含量較高的共有香氣成分有反,反-2,4-庚二烯醛、甲基庚烯酮、2-戊基呋喃、香葉基丙酮、3,5-辛二烯-2-酮（E,E）、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮等。

有研究[22]表明，茯磚茶香氣化合物主要以醇類和酯類為主，而本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，湖南茯磚茶的香氣化合物主要是醛類和酮類化合物?？赡芘c不同的香氣物質(zhì)提取方式有關(guān)。前者采用的是同時蒸餾萃取法，萃取時間長、產(chǎn)量高，易得到高沸點的化合物。如蒸餾后反,反-2,4-庚二烯醛、反-2-葵烯醛等幾乎檢測不到，而產(chǎn)生了一些亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯和亞麻酸乙酯等化合物。同時，有研究認為同時蒸餾萃取法萃取過程中的一些次生反應有可能導致檢測結(jié)果的失真現(xiàn)象[23-24]。而SPME法不需要有機試劑，萃取得到的揮發(fā)性化合物更能貼近茶葉本身的香型。結(jié)果表明，SPME-GC-TOF-MS法應用于湖南茯磚茶香氣成分的提取、分析和鑒定，不需要復雜的香精油制備前處理過程，再結(jié)合TOF-MS強大的數(shù)據(jù)采集功能，是一種較真實地反映湖南茯磚典型香氣特征的分析手段。

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Analysis of Aroma Composition in Hunan Fuzhuan Tea by Solid-Phase Microextraction Combined with Gas Chromatography-Time of Flight-Mass Spectrometry

YAN Hong-fei1,2, WANG Mei-ling1,2, BAI Xiu-zhi2, ZHU Shao-hua1,2, DAI Hua1, LI Yong-jun1,2,*
(1. Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changsha 410004, China; 2. National Key Testing Laboratory of Food Safety, Changsha 410004, China)

The aroma components of Hunan Fuzhuan tea were extracted by space solid phase microextraction (SPME) technique and determined by gas chromatography-time of flight-mass spectrometry (GC-TOF-MS). The optimum extraction conditions were determined as follows: DVB/CAR/PDMS extraction head (30/50 ?m), extraction temperature 80 ℃, and extraction time 60 min. A total of 93 aroma components of Hunan Fuzhuan tea accounting for over 90% of the total volatile components were identified, including ketones, aldehydes, hydrocarbon, heterocyclicoxygen compounds, alcohols, acids, esters, and nitrogen-containing compounds. There were 50 same aroma components identified in three kinds of Fuzhuan teas, where the major volatile components were E,E-2,4-heptadienal, 6-methyl-5-hepten-2-one, 2-pentyl-furan, geranyl acetone, 3,5-octadiene-2-one (E,E), 6-methyl-3,5-heptadien-2-one, and so on.

solid phase microextraction (SPME); gas chromatography-time of flight-mass spectrometry (GC-TOF-MS); Hunan Fuzhuan tea; aroma composition

TS272

A

1002-6630（2014）22-0176-05

10.7506/spkx1002-6630-201422033

2014-03-04

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2012IK160）

顏鴻飛（1980—），男，工程師，碩士，研究方向為食品安全分析檢測。E-mail：yanhf@hnciq.gov.cn

*通信作者：李擁軍（1971—）男，研究員，博士，研究方向為食品安全分析檢測和風險評估。E-mail：liyj@hnciq.gov.cn