水解脫脂麥胚蛋白工藝及抗氧化性

陳美玲，胡 妍，韓 勇，邢 月，潘崇雙，高 昂，陳 野*

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

水解脫脂麥胚蛋白工藝及抗氧化性

陳美玲，胡 妍，韓 勇，邢 月，潘崇雙，高 昂，陳 野*

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

以水解度為指標，采用堿性蛋白酶對脫脂小麥胚芽蛋白進行水解，優(yōu)化水解條件，當在pH 8、溫度50 ℃、加酶量5.0%、底物質量分數(shù)4.0%的條件下，水解度達20.08%。優(yōu)化條件下，得到水解物的溶解度、吸水性、吸油性分別為48.59%，13.77、9.86 g/100 g。熱特性分析結果表明，水解物在200 ℃以內(nèi)具有良好的熱穩(wěn)定性；通過紅外光譜分析水解后的麥胚蛋白結構；由基質輔助激光解吸電離串級飛行時間質譜儀對分子質量的測定結果表明，水解物的分子質量大部分集中在2 000 D以下；體外抗氧化實驗表明，水解物有良好的抗氧化性。

麥胚蛋白；堿性蛋白酶；水解；抗氧化

麥胚是小麥加工的副產(chǎn)物，其中蛋白質含量高達30%以上，而且麥胚蛋白是一種完全蛋白，含有人體必需的8 種氨基酸[1]。此外，麥胚還富含豐富的B族維生素、VE、不飽和脂肪酸、賴氨酸、膳食纖維和一些具有功能性的微量元素[2]。

麥胚蛋白在酶的作用下多肽鏈被打斷，會釋放出各種肽類化合物，使其功能性質得到改善，并具有一定的生物活性[3-4]。同時，張洪微[3]、殷微微[5]等研究表明，麥胚蛋白經(jīng)過水解后的多肽具有抗氧化活性，多肽的抗氧化活性還同分子質量有關。

本研究采用堿性蛋白酶對脫脂麥胚蛋白進行水解，測其物理性質及水解物的結構，以及不同質量濃度麥胚蛋白水解物的抗氧化性，為開發(fā)具有抗氧化性的麥胚多肽產(chǎn)品提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮小麥胚芽 山東恒仁工貿(mào)有限公司；堿性蛋白酶、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

RE-52AA旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠；DSC-60A差示掃描量熱儀 日本島津有限公司；VECTOR 22傅里葉變換紅外光譜儀、UltraFlex基質輔助激光解吸電離串級飛行時間質譜儀 布魯克儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 基本成分的測定

粗脂肪、蛋白質、灰分含量均采用國標[6-8]的方法測定。

1.3.2 脫脂麥胚蛋白的制備

將新鮮小麥胚芽置于燒杯中，試劑（正己烷-丙酮體積比3∶1）與樣品按4∶1（mL/g）的比例攪拌均勻，置于35 ℃恒溫水浴鍋中浸提6 h脫脂[9]，在此期間，多次攪動，低溫烘干，測其脂肪含量。

用粉碎機將上述脫脂麥胚粉碎，全部過80 目篩，將細化的樣品按料水比為1∶20（g/mL）攪拌均勻，用0.5 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH 9.0，攪拌浸提30 min，將浸提液于3 500 r/min離心20 min，取上清液，然后用1.0 mol/L HCl溶液將上清液的pH值調至6.3，加入適量的淀粉酶[10]，并置于60 ℃的水浴鍋中，酶解至遇碘不呈藍色為止，將溶液pH值調為4.0，然后離心去上清液，冷凍干燥得脫脂麥胚蛋白。

1.3.3 酶解條件的分析

利用堿性蛋白酶在不同的pH值、溫度、加酶量（E/S）、底物質量分數(shù)等條件下測定脫脂麥胚蛋白的水解度。首先將脫脂麥胚蛋白與一定比例的水混合，然后攪拌均勻。設定不同的pH值（6、7、8、9、10），溫度（40、45、50、55、60 ℃），加酶量（E/S）（3%、4%、5%、6%、7%）以及底物質量分數(shù)（2%、3%、4%、5%、6%），酶解3 h，沸水浴滅酶10 min，冷卻后測其水解度（degree of hydrolysis，DH）[11]，見式（1），剩余部分將其冷凍干燥備用。

式中：DH為蛋白水解度；H為水解斷裂的肽鍵數(shù)目（由甲醛快速滴定法測定）；Htot為總肽鍵數(shù)目（由凱氏定氮法測定）。

1.3.4 酶解脫脂麥胚蛋白正交試驗設計

本研究在單因素試驗的基礎上，選擇L9（34）的正交表，研究溫度、pH值、加酶量（E/S）、底物質量分數(shù)對麥胚蛋白水解度的影響。

表1 酶解麥胚蛋白正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design for optimizing enzymatic hydrolysis of wheat germ protein

1.3.5 溶解度的測定

取0.5 g樣品置于100 mL 燒杯中，加入30 mL蒸餾水，攪拌30 min，然后10 000×g離心15 min 后取上清液，采用微量凱氏定氮法測定上清液中蛋白質含量。溶解度表示為上清液中蛋白質含量與總蛋白質含量的比值[12]。

1.3.6 吸水性和吸油性的測定

取2.0 g的樣品置于預先干燥好的離心管中（已知離心管的質量m），加入100 g蒸餾水，充分攪拌混勻后，靜置30 min，然后以3 500 r/min的速度離心20 min，將離心管上層的水（大豆色拉油）全部舍棄，將離心管和沉淀的質量計為m2，吸水性、吸油性以每克樣品吸附的水（油）的克數(shù)表示[13]。計算見公式（2）：

式中：m0為樣品質量/g；m1為樣品加離心管質量/g；m2為離心后離心管加沉淀質量/g。

1.3.7 熱性能分析

稱量2～4 mg麥胚蛋白和麥胚蛋白水解物，采用差示掃描量熱儀對樣品進行熱穩(wěn)定性分析。其中升溫速率為5 ℃/min，測定溫度范圍為20～200 ℃。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析

取0.8 mg麥胚蛋白水解物樣品與200 mg純KBr粉末置于瑪瑙研缽內(nèi)，將其研細混勻。置于模具中，在油壓機上壓片，加壓到0.6～0.8 GPa后維持2 min。采用傅里葉紅外變換光譜儀在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)測定，掃描次數(shù)32 次，分辨率4 cm-1。

1.3.9 分子質量的測定

首先為何會出現(xiàn)溝通難題，最主要的還是雙方所處的立場和利益是不同的。隊長希望能夠保證施工班組的完整性，不耽誤施工進度，而班組人員考慮的是自己的公平利益，雙方看問題的角度是有差距的。問題發(fā)生以后，我決定參與進來，溝通這個難題，是因為于公于私我都應該幫助解決問題，而且我是一個工程技術管理人員，比較有獨立性和公正性，易于接受，利于解決問題。再者問題的解決也有利于我在隊中工作的展開。問題解決中我始終是站在中立者的角度去詢問雙方看法，積極傾聽，評估事實，分享觀點。進而解決的問題，說明的雙方的在的難題是差異而不是缺陷，確定的共識領域是都不能耽誤正常的生產(chǎn)，最后能夠共同探討解決方案。

取質量濃度為0.2 mg/mL麥胚蛋白水解物，加入飽和基質間羥基肉桂酸，按1∶1的比例混合，取1 ?L點靶，冷卻自然干燥，待結晶析出，測定。本研究采用基質輔助激光解吸電離串級飛行時間質譜分析，質譜條件：激光器為Nd∶SmartbeamⅡ，加速電壓為25 kV，采用反射正離子模式采集數(shù)據(jù)，PMF質量掃描范圍m/z 700～3 500 D，激光頻率2 000 Hz，激光激發(fā)500 次。

1.3.10 麥胚蛋白水解物抗氧化性的測定

1.3.1 0.1 還原力[14]

取1 mL質量濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/mL的脫脂麥胚蛋白酶解液，加入2.5 mL 0.01 mol/L（pH 6.6）的磷酸鹽緩沖液，3.0 mL 1 g/mL的鐵氰化鉀溶液，置于50 ℃恒溫水浴中反應20 min，再加入2.5 mL 10 g/mL的三氯乙酸，混合均勻后以3 500 r/min離心10 min，取3.0 mL上清液，并加入3.0 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1 g/mL的FeCl3溶液，混合均勻，室溫靜置15 min后，在波長700 nm處測定吸光度A，以相同質量濃度的VC做對照實驗。

1.3.1 0.2 DPPH自由基清除率[15]

取2.0 mL質量濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/mL的脫脂麥胚蛋白酶解液，加入1.0×10-4mol/L的DPPH自由基、無水乙醇溶液2.0 mL，混勻后在室溫避光保存20 min，然后在4 000 r/min離心10 min，取上清液在517 nm波長處測定Ai，以相同質量濃度的VC做對照實驗。DPPH自由基清除率計算見公式（3）。

式中：A0為未加樣品DPPH自由基的吸光度；Ai為加樣品DPPH自由基的吸光度；Aj為樣品與無水乙醇的吸光度。

1.3.1 0.3 超氧陰離子自由基（O2-·）清除率[16]

向試管中分別加入1 mL 50 mmol/L的 Tris-HCl緩沖溶液，1.0 mL 1 mmol/L的EDTA溶液，然后再加入0.4 mL質量濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/mL的脫脂麥胚蛋白酶解液以及1.0 mL 0.4 mmol/L的鄰苯三酚，混合均勻，靜置反應10 min后，加入30 ?L 100 mmol/L的二硫蘇糖醇溶液終止反應，在波長325 nm處測定吸光度A，以相同質量濃度的VC做對照實驗，樣品對O2-·的清除能力，見公式（4）。

式中：A0為鄰苯三酚與溶劑混合液的吸光度；A1為鄰苯三酚與樣品反應的吸光度；A2為樣品與溶劑混合液的吸光度。

1.3.1 0.4 羥自由基（?OH）清除率[17]

依次向試管中加入1.0 mL 9.0 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，1.0 mL質量濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/mL的脫脂麥胚蛋白酶解液，1.0 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液，5.0 mL蒸餾水，最后加10.0 mL 88 mmol/L的H2O2溶液啟動反應，搖勻后于510 nm波長處測定吸光度Ai，取0.5 mL的蒸餾水代替Fe2+溶液所測得的吸光度為Aj，以相同質量濃度的VC做對照實驗。?OH清除率計算見公式（5）。

2 結果與分析

2.1 基本成分的測定結果

表2 小麥胚芽及脫脂小麥胚芽的基本成分比較Table 2 Proximate composition comparison between wheat germ and defatted wheat germ %

小麥胚芽脫脂前后的基本成分進行比較分析，結果如表2所示，其中脂肪含量明顯下降，說明脫脂效果比較好，去除大部分油脂，這將對麥胚蛋白的提取有較小的影響；此外蛋白質含量有較小的增加，原因可能是在脫脂處理過程中，使部分麥胚蛋白變性[18]，導致蛋白含量增加的幅度不大。

2.2 酶解脫脂麥胚蛋白的單因素試驗分析

2.2.1 溫度對麥胚蛋白水解度的影響

圖1 溫度對水解度的影響Fig.1 Effect of temperature on the hydrolysis degree

由圖1可知，水解度隨溫度的升高先增大后減少。溫度為50 ℃時，水解度達到最大。不同酶的最適溫度不同，在最適溫度時，酶的活力最大，提高溫度可以加快酶的反應速度，但是隨著溫度的不斷升高，同時也加快了酶失活的速度，因此，水解溫度選擇為50 ℃左右。

2.2.2 pH值對麥胚蛋白水解度的影響

圖2 pH值對水解度的影響Fig.2 Effect of pH on the hydrolysis degree

由圖2可知，麥胚蛋白的水解度隨著pH值的不斷增大而呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，當pH值為8時酶解效果最佳，水解度最大。不同酶的最適pH值不同，在最適pH值附近時，酶活力最大，而在偏酸或偏堿的條件下，會導致部分蛋白酶變性失活，因為pH值能夠破壞酶的空間結構，改變酶的構象，以致酶活性降低甚至喪失。因此，通過實驗得出水解麥胚蛋白較佳的pH值為8。

2.2.3 加酶量（E/S）對麥胚蛋白水解度的影響

由圖3可知，隨著加酶量的增加，水解度逐漸增加，最后趨于平緩，當加酶量為6.0%時，水解度為19.02%。加酶量在3.0%～6.0%范圍內(nèi)時，隨著加酶量的增加，水解度逐漸上升，當加酶量超出3.0%～6.0%范圍之后，水解度趨于平緩，原因是酶質量濃度逐漸增大并趨于飽和，酶解速度也趨于飽和，繼續(xù)增大加酶量對反應速率影響不大，因此加酶量選擇在6.0%左右。

圖3 加酶量對水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on the hydrolysis degree

2.2.4 底物質量分數(shù)對麥胚蛋白水解度的影響

圖4 底物質量分數(shù)對水解度的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the hydrolysis degree

由圖4可知，隨著底物質量分數(shù)的增大，麥胚蛋白的水解度先上升后逐漸下降，4.0%時達到最大。原因是當?shù)孜镔|量分數(shù)較低時，酶分子與底物的碰撞機會增多，加快了反應的進行，隨著底物質量分數(shù)的增加，反應體系的底物質量濃度逐漸加大，減少了酶和底物的碰撞機會，水解反應受到抑制。因此，底物質量分數(shù)選擇為4.0 %左右。

2.3 酶解脫脂麥胚蛋白的條件優(yōu)化結果分析

表3 酶解麥胚蛋白正交試驗設計及結果Table 3 Orthogonal array design with experimental results for optimizing the hydrolysis of wheat germ protein

由表3極差R的大小可知，4 個因素對麥胚蛋白水解度影響大小依次為：B＞A＞D＞C，即pH值對麥胚蛋白水解度影響最大，其次是溫度、底物質量分數(shù)、加酶量（E/S）。結果可知，最適水解條件為：溫度為50 ℃、pH 8、加酶量5.0%、底物質量分數(shù)4.0%。由上述正交試驗得到的最適水解條件進行驗證實驗，得到的水解度為20.08%。

2.4 麥胚蛋白水解物物理性質的結果分析由表4可知，麥胚蛋白水解物的溶解度明顯高于麥胚蛋白，這是由于水解過程中，肽鍵斷裂，產(chǎn)生了更多帶電基團（即NH3+和COO-），它們增強了蛋白質和水的相互作用，在多肽之間產(chǎn)生更強的靜電斥力[19]。因此，水解物在水溶液中有較好的溶解性。水解物的吸水性和吸油性也高于麥胚蛋白，原因可能是由于多肽鏈的斷裂會使部分氨基和羧基釋放，導致親水性增強，此外，蛋白經(jīng)酶解后大量的基團外露，極性基團增加，形成氫鍵的能力增強，因此酶解后的麥胚蛋白結合水的能力增加[20]，導致吸水性增強；另一方面，可能是由于蛋白分子結構改變，分子中疏水基團暴露，致使水解物的吸油性也有所提高。

表4 麥胚蛋白水解物物理性質分析Table 4 Physical properties of wheat germ protein hydrolysate

2.5 熱性能分析

圖5 熱性能分析Fig.5 Analysis of thermal properties

從圖5可以看出，脫脂麥胚蛋白與經(jīng)酶解處理后的麥胚蛋白差示掃描量熱曲線趨勢基本一致。在70～100 ℃之間表現(xiàn)為脫脂麥胚蛋白水分的吸熱，其后至200 ℃沒有出現(xiàn)吸放熱的變化，說明在200 ℃之前經(jīng)酶解處理過的麥胚蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.6 傅里葉變換紅外光譜掃描

從圖6可以看到，在1 079.894 cm-1存在著明顯的紅外吸收，這是—OH基團伸縮峰的特征吸收頻率。波數(shù)在1 242.109 cm-1的吸收帶，是由于C—N鍵（酰胺Ⅲ，也具有雙鍵性質）的伸縮振動和N—H鍵（酰胺Ⅱ）的面內(nèi)彎曲振動共同引起的。1 550 cm-1頻率附近的譜帶，對應著蛋白質特征性N—H鍵（酰胺Ⅱ）的角變形，即面內(nèi)彎曲振動模式。由于水分子的影響，可能會造成酰胺Ⅱ帶的位置在1 530～1 570 cm-1范圍內(nèi)發(fā)生移動[21]。酶解后麥胚蛋白的酰胺Ⅱ帶出現(xiàn)在1 547.112 cm-1；波數(shù)在1 651.442 cm-1的特征吸收為酰胺Ⅰ譜帶，是由C=O鍵的伸縮振動即軸向變形關聯(lián)的特征性強吸收帶。有相關資料顯示，該振動模式的頻率是由肽鏈構型決定的，而一般不受肽鏈側基的影響[22]。此外，1 399.122 cm-1和1 451.931 cm-1波數(shù)下出現(xiàn)的明顯特征吸收峰—OH面內(nèi)彎曲以及2 026.105 cm-1NH3的伸縮振動。

圖6 酶解后的小麥胚芽蛋白傅里葉變換紅外掃描圖譜Fig.6 FT-IR spectrum of wheat germ protein hydrolysate

2.7 基質輔助激光解吸電離串級飛行時間質譜測定分子質量

圖7 基質輔助激光解吸電離串級飛行時間質譜儀對分子質量的測定Fig.7 MALDI-TOF-TOF mass spectrometry showing the molecular weight distribution

由圖7可知，麥胚蛋白水解物的分子質量大部分集中在2 000 D以下。麥胚蛋白水解物的抗氧化性與其分子質量大小密切相關，原因可能是短肽中含有某些能與自由基反應的供氫基團，短肽只有在適當分子質量時，這些特殊的供氫基團才能得到最大的暴露，充分與自由基作用，此時才具有較強的抗氧化活性。

2.8 酶解麥胚蛋白水解物的抗氧化活性

2.8.1 還原力

抗氧化劑是通過自身的還原作用，釋放出電子而清除自由基，還原力越強，抗氧化性越強。樣品的抗氧化性能使鐵氰化鉀的Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+進一步在和FeCl3的反應下生成在700 nm波長處有最大吸光度的普魯士藍，因此測定700 nm波長處吸光度的高低可以間接反映抗氧化劑的還原能力大小，吸光度越大，還原能力越強[23]。如圖8所示，在質量濃度為0.1～10 mg/mL 的范圍內(nèi)，麥胚蛋白水解物的還原力先趨于平緩后逐漸增大，但低于VC。

圖8 麥胚蛋白水解物的還原力Fig.8 Reducing power of wheat germ protein hydrolysate

2.8.2 DPPH自由基清除率

圖9 麥胚蛋白水解物對DPPH自由基的清除率Fig.9 Scavenging activity of wheat germ protein hydrolysate against DPPH free radical

從圖9可以看出，在質量濃度為0.1～10 mg/mL的范圍內(nèi)，酶解麥胚蛋白水解物的DPPH自由基清除率隨質量濃度的增大而增大。在質量濃度為10 mg/mL時，VC和麥胚蛋白水解物的清除率分別為94.3%和84.5%，說明麥胚蛋白水解物對DPPH自由基有一定的清除能力。

2.8.3 O2-·清除率

圖10 麥胚蛋白水解物對的清除率Fig.10 Scavenging activity of wheat germ protein hydrolysate against superoxide anion free radical

O2-·作為生物體所產(chǎn)生的一種自由基，大量研究證明，自由基的作用與生物衰老、某些疾病的發(fā)病機制密切相關[24]。麥胚蛋白水解物對O2-·的清除率，結果如10所示。在質量濃度為 0.1～10 mg/mL的范圍內(nèi)，VC和麥胚蛋白水解物對O2-·的清除率隨質量濃度的增大而增大。在質量濃度為10 mg/mL時，VC和麥胚蛋白水解物的清除率分別為89.9%和67.0%，麥胚蛋白水解物的清除率低于VC。

2.8.4 ·OH清除率

圖11 麥胚蛋白水解物對?OH的清除率Fig.11 Scavenging activity of wheat germ protein hydrolysate against hydroxyl free radical

·OH是體內(nèi)最活潑的活性氧自由基，會導致許多病理變化。本研究采用麥胚蛋白水解物對Fenton體系產(chǎn)生的·OH清除率的體外實驗進行測定[25]。由圖11可知，在質量濃度為0.1～10 mg/mL的范圍內(nèi)，酶解麥胚蛋白水解物的·OH清除率隨質量濃度的增大而增大。在質量濃度為 10 mg/mL時，VC和麥胚蛋白水解物的清除率分別為99.0%和81.2%，麥胚蛋白水解物對·OH的清除能力略低于VC。

3 結 論

本研究以脫脂麥胚蛋白為原料，研究了水解脫脂麥胚蛋白的生產(chǎn)工藝，在pH8、溫度50 ℃、加酶量（E/S）5.0%、底物質量分數(shù)4.0%的條件下，水解度達20.08%，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了基礎數(shù)據(jù)，同時對水解物的溶解度、吸水性、吸油性進行了分析，結果均高于麥胚蛋白，抗氧化實驗證明水解后的麥胚蛋白具有較高的抗氧化性，對于工業(yè)化生產(chǎn)應用具有良好的前景。

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Hydrolysis and Antioxidant Activity of Defatted Wheat Germ Protein

CHEN Mei-ling, HU Yan, HAN Yong, XING Yue, PAN Chong-shuang, GAO Ang, CHEN Ye*
(College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

The enzymatic hydrolysis of defatted wheat germ protein using alkaline protease was optimized based on degree of hydrolysis (DH). When the hydrolysis was carried out at 50 ℃ with an initial pH of 8 at an enzyme dose of 5.0% and a substrate concentration of 4.0%, a DH value up to 20.08% was achieved and the hydrolysate showed 48.59%, 13.77 and 9.86 g/100 g for solubility, hygroscopicity and oil absorption, respectively. Thermal analysis indicated that the hydrolysate was thermally stable at a temperature below 200 ℃, and its structure was analyzed as well by infrared spectroscopy. MALDI-TOF-TOF mass spectrometry data showed that the molecular weights of its major components were below 2 000 D. Meanwhile, this hydrolysate exhibited a strong antioxidant activity in vitro.

wheat germ protein; alkaline protease; hydrolysis; antioxidant activity

TS209

A

1002-6630（2014）22-0109-06

10.7506/spkx1002-6630-201422020

2014-06-04

陳美玲（1988—），女，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：meiling_ch@163.com

*通信作者：陳野（1968—），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：chenye@tust.edu.cn