草魚內臟蛋白酶解產物美拉德反應制備調味基料

叢艷君，苘鈺婷，易 紅

（北京工商大學食品學院，北京市食品風味化學重點實驗室，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

草魚內臟蛋白酶解產物美拉德反應制備調味基料

叢艷君，苘鈺婷，易 紅

（北京工商大學食品學院，北京市食品風味化學重點實驗室，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

將草魚內臟蛋白酶解液與葡萄糖進行美拉德反應后制備出了風味良好的調味基料，最佳反應基本條件為羰氨物質的量比1∶2、反應溫度110 ℃、反應時間30 min、反應pH 8。感官評價表明肉香味和魚香味較強烈。利用氣相色譜-嗅聞-質譜聯(lián)用儀對美拉德反應前后香氣化合物成分進行分析，發(fā)現(xiàn)經過美拉德反應之后，香氣活性化合物明顯增多，檢測到19 種香氣活性化合物，其中包括酮類3 種、醛類3 種、酯類1 種、呋喃類4 種、吡嗪類1 種、噻唑類1 種、萜類2 種、烯類2 種、醚類1 種、酸類1 種。

草魚內臟；美拉德反應；風味

目前世界漁業(yè)產量正處于穩(wěn)定時期，每年大約有26.4億 t的產量[1]，僅內臟廢棄物就可以達到300 000 t[2]。在魚類加工中，產生大量的包括魚頭、魚骨、魚鱗和內臟等下腳料，其中魚內臟的含量最大。草魚是中國淡水養(yǎng)殖魚類中產量最高的魚種，2010年，草魚產量達到422.22萬 t[3]。目前，我國水產品加工率不到30%，遠遠低于發(fā)達國家（＞80%），對下腳料的利用更少[4]，多數(shù)企業(yè)將其作為固體廢棄物處理，造成了資源浪費和環(huán)境污染，因此，有效利用魚類加工副產物的研究，減輕環(huán)境污染，一直是人們積極探討的問題。草魚內臟中富含的氨基酸、有機酸及核苷酸等呈味物質[5]，是生產純天然調味品的理想原材料[6]。

本實驗以脫脂草魚內臟蛋白水解液作為原料，制備美拉德反應調味基料并分析了香味成分，為以后制備新型復合調味料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚內臟購于北京市四道口水產品批發(fā)市場。

木瓜蛋白酶（酶活力4 982 U/g） 美國Sigma公司；乙醚、濃硫酸、鹽酸、硼酸、硫酸鉀 北京化學試劑公司；氫氧化鈉 西隴化工股份有限公司；甲醛 天津市永大化學試劑公司；硫酸銅 天津市光復科技發(fā)展有限公司；溴甲酚綠-甲基紅（質量分數(shù)0.2%的甲基紅乙醇（95%）溶液和0.2%的溴甲酚綠無水乙醇溶液以體積比5∶1混合） 本實驗室自制；系列烷烴（C7～C22，均為色譜純） 北京化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

DKB-501A超級恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司；PHS-3D功能型pH計 上海三信儀表廠；TB214型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；CR22G型離心機 日本Hitachi公司；Kejeltic 2100型凱氏定氮儀 瑞士Foss公司；D2004W電動攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；Spectrumlab 22pc可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；YX-280D型滅菌鍋江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；7890A-7000氣相色譜-質譜聯(lián)機、DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美國Agilent公司；ODP2嗅聞檢測儀 德國Gerstal公司；萃取瓶 北京玻璃儀器廠；DVB/CAR/PDMS手動固相微萃取進樣器（50/30 μm） 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂草魚內臟蛋白酶解產物的制備

將去除膽囊和魚鰾的草魚內臟清洗，絞碎，置于95 ℃水浴鍋中20 min，滅內源酶活[7-8]。冷卻后按料液比1∶1（g/mL）加入去離子水，在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心10 min，去除上層液體，收集下層沉淀。重復上述操作3 次，得到粗脫脂草魚內臟蛋白質。以脫脂草魚內臟蛋白為底物恒溫水浴酶解，添加木瓜蛋白酶66.84 mg、反應溫度62.35 ℃、反應時間5.37 h、pH 7.9，酶解結束時將酶解液在95 ℃水浴中滅酶15 min。

1.3.2 美拉德反應基本條件的確定

取定量草魚內臟水解液，采取單因素控制變量法分別控制葡萄糖添加量（羰氨物質的量比）、反應體系初始pH值、反應溫度、反應時間這4個單因素進行美拉德反應，測定反應液中的氨態(tài)氮含量，計算反應后的氨態(tài)氮損失率，并進行感官評定。

氨態(tài)氮的測定：甲醛電位滴定法[9]。

蛋白質含量測定：采用雙縮脲法，多肽含量為蛋白質總量-氨態(tài)氮的量[10]。

感官評定：感官評價采用排序檢驗法測定[11-12]，選12 位評價員（6男6女，23～50 歲），有超過200 h的感官評價經驗， 以表1為感官評價參考標準。將美拉德反應液作為品嘗對象，比較待測樣品與對照樣品中滋味感差別，評價其滋味。美拉德反應液放入口中15 s吐出，每個樣品給兩次，打分采用五分制。評定前用清水漱口，評定時拒絕交流，且樣品需用帶中性的文字標明，避免主觀評價。

表1 感官評價的標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Maillard reaction products (MRPs)

1.3.3 固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）-氣相色譜-嗅聞-質譜（gas chromatographolfactometry-mass spectrometer，GC-O-MS）聯(lián)用儀對揮發(fā)性風味物質的檢測

稱取5 mL待測液，裝入固相微萃取小瓶，密封，50 ℃水浴平衡30 min，然后將固相微萃取針頭插入小瓶中，推動手柄使纖維頭處于頂空狀態(tài)，吸附30 min，進樣。

DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），程序升溫：初始溫度40 ℃，保持3min，以5 ℃/min速率升溫到200 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min速率升溫到240 ℃，保持5 min。載氣氦氣（He），恒定流速1.2 mL/min，進樣口溫度250 ℃，壓強14.87 psi，不分流。

質譜條件：接口溫度280 ℃，電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min，質譜掃描范圍40～600 u。

嗅覺檢測器：接口溫度為200 ℃。用預處理后的樣品和標準香氣化合物對3 位評價員組成的感官評價小組進行培訓后，方可進行實驗。在嗅覺檢測口，感官評價人員及時記錄下嗅聞到的香味時間，香味特性和香氣強度。至少2 人描述一致時才可確定其為香氣活性化合物。

化合物定性：通過檢索質譜庫NIST08提供的標準質譜圖，僅當正反匹配度均大于800（最大值1 000）的化合物才給予列出，并標記為MS；通過系列烷烴計算出未知化合物的保留指數(shù)（retention index，RI），并與標準化合物進行比對，一致者標記為RI；評價員嗅聞到的香味與標準化合物的芳香特性相對比，相符者予以標記為O。RI公式如下：

式中：ta為樣品a的保留時間；tn為系列烷烴Cn的保留時間；n為系列烷烴碳的個數(shù)。

2 結果與分析

2.1 羰氨物質的量比對美拉德反應的影響

圖1 羰氨物質的量比對氨態(tài)氮損失率的影響Fig.1 Effect of carbonyl/ammonia molar ratio on amino nitrogen loss

圖2 羰氨物質的量比對多肽含量的影響Fig.2 Effect of carbonyl/ammonia molar ratio on peptide content

取定量草魚內臟水解液，分別按不同的羰氨物質的量比1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1加入葡萄糖，混勻后調節(jié)pH值至7，置于110 ℃條件下反應l h，測定反應液中的氨態(tài)氮含量，計算反應后的氨態(tài)氮損失率，并進行感官評定。

表2 羰氨物質的量比對水解液風味的感官評價Table 2 Effect of carbonyl/ammonia molar ratio on flavor characteristics of MRPs

由圖1、2和表2可以看出，隨著羰基比例的增加氨基酸的損失率先增加而后稍微趨于平穩(wěn)，多肽含量也是先呈下降趨勢而后升高，說明在羰氨物質的量比為1∶2時羰基和氨基的量最適合美拉德反應體系，整個體系反應最為充分，肉香味和鮮味都有先增強后減弱，酸味和腥味較強。方差分析顯示氨態(tài)氮損失率在羰氨物質的量比各比例之間差異均顯著（P＜0.05），多肽含量在羰氨物質的量比1∶3與1∶2之間差異顯著，其他比例之間差異不顯著，綜合考慮，羰氨物質的量比1∶2為適宜。

2.2 體系初始pH值對美拉德反應的影響

圖3 pH值對氨態(tài)氮損失率的影響Fig.3 Effect of pH on amino nitrogen loss

圖4 pH值對多肽含量的影響Fig.4 Effect of pH on peptide content

表3 pH值對水解液風味的感官評價Table 3 Effect of pH on flavor characteristics of MRPs

取定量草魚內臟水解液，按羰氨物質的量比1∶2加入葡萄糖，分別調節(jié)不同的初始pH值為5、6、7、8、9，置于110 ℃條件下反應l h，測定反應液中的氨態(tài)氮含量，計算反應后的氨態(tài)氮損失率，并進行感官評定。由圖3、4和表3可以看出，隨著pH值的增加，氨態(tài)氮的損失率呈先增加后減少的趨勢，多肽含量呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，這說明美拉德反應在pH 8時反應最為劇烈；就感官而言，隨著pH值的升高，產物的魚腥味、苦味、酸味等不愉快氣味逐漸增強，肉香味、鮮味和魚香味逐漸增強，脂肪味沒有變化。顯著性分析顯示氨態(tài)氮損失率在各pH值之間差異都顯著（P＜0.05），多肽含量在pH值為8與9之間差異顯著，其他相鄰pH值之間差異不顯著，綜合考慮，適宜pH 8。

2.3 反應溫度對美拉德反應的影響

圖5 反應溫度對氨態(tài)氮損失率的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on amino nitrogen loss

圖6 反應溫度對多肽含量的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on peptide content

取定量草魚內臟水解液，按羰氨物質的量比1∶2加入葡萄糖，混勻后調節(jié)pH值至7，分別置于80、90、100、110、120 ℃條件下反應l h，測定反應液中的氨態(tài)氮含量，計算反應后的氨態(tài)氮損失率，并進行感官評定。

表4 反應溫度對水解液風味的感官評價Table 4 Effect of reaction temperature on flavor characteristics of MRPs

由圖5、6和表4可以看出，隨著反應溫度的升高，氨態(tài)氮的損失率呈先增加后平穩(wěn)的趨勢，多肽含量先降低后趨于平穩(wěn)，這說明美拉德反應在溫度為110 ℃時反應最為劇烈；從感官評價方面看，在低于100 ℃時，產物脂肪味、魚腥味都較重，而高于100 ℃以后，脂肪味、魚腥味、澀味基本無變化，且肉香味和魚香味較強烈，但達到120 ℃時，有較弱的焦糖味出現(xiàn)。顯著性分析顯示氨態(tài)氮損失率在各相鄰溫度之間差異都顯著（P＜0.05），多肽含量在80 ℃與90 ℃之間差異顯著，其他相鄰溫度之間差異不顯著，綜合考慮，適宜溫度為110 ℃。

2.4 反應時間對美拉德反應的影響

取定量草魚內臟水解液，按羰氨物質的量比1∶2加入葡萄糖，混勻后調節(jié)pH值至7，置于110 ℃條件下反應時間分別為20、30、40、50、60 min，測定反應液中的氨態(tài)氮含量，計算反應后的氨態(tài)氮損失率，并進行感官評定。由圖7、8和表5可以看出，隨著反應時間的延長，氨態(tài)氮損失率呈先增加后平穩(wěn)的趨勢，多肽含量呈現(xiàn)升高的趨勢，這說明美拉德反應在時間為30 min

圖7 反應時間對氨態(tài)氮損失率的影響Fig.7 Effect of reaction times on amino nitrogen loss

表5 反應時間對水解液風味的影響Table 5 Effect of reaction time on flavor characteristics of MRPs

時反應最為劇烈；就感官而言，隨著時間的延長，產物的魚腥味、苦味、酸味等不愉快氣味逐漸減弱，肉香味逐漸增強。顯著性分析顯示氨態(tài)氮損失率在時間為20、30、50 min之間差異顯著（P＜0.05），多肽含量在各溫度之間差異均顯著，綜合考慮，適宜溫度為30 min。

2.5 美拉德反應前后SPME-GC-O-MS分析結果

表6 酶解液中的香氣活性化合物Table 6 Aroma-active compounds of the hydrolysate

表7 美拉德反應液中的香氣活性化合物Table 7 Aroma-active compounds of MRPs

從表6、7可以看出，美拉德反應前后揮發(fā)性風味成分發(fā)生了變化，從木瓜蛋白酶水解得到的酶解液中共檢測到12 種香氣活性化合物，其中包括酮類3 種、醛類3 種、酯類1 種、呋喃類1 種、醚類1 種、萜類1 種、烯類2 種。經過美拉德反應之后，香氣活性化合物明顯增多，檢測到19 種香氣活性化合物，其中包括酮類3 種、醛類3 種、酯類1 種、呋喃類4 種、吡嗪類1 種、噻唑類1 種、萜類2 種、烯類2 種、醚類1 種、酸類1 種。

3 討論與結論

目前，應用美拉德反應制備水產調味料的報道比較多。陳軍等[13]在羅非魚下腳料酶解液美拉德反應制備肉類風味物工藝的研究中，通過控制反應體系的pH值、反應時間、反應溫度和葡萄糖與木糖添加量的比值來進行反應，從反應得到的肉香味和鮮味的濃郁程度、色澤的深淺、有無腥味等方面來進行感官分析，最終得出的最佳反應條件為pH 7.0、反應時間90 min、反應溫度115 ℃、葡萄糖∶木糖=4∶1。張彩菊等[14]以鳙魚酶解產物為基料進行魚味香料制備的研究中發(fā)現(xiàn)，pH值、反應時間、反應溫度和反應物體積分數(shù)對產品的感官性能有較顯著的影響，4 個要素相互作用，最終決定反應得到的調味基料風味如何。研究還發(fā)現(xiàn)產生魚香味的前提物質就是酶解產物中存在的氨基酸、短肽、蛋白質等，這些也是產生強烈魚香味的必要條件。喬路等[15]從鮮味、咸味、腥味和苦味4 個方面對美拉德反應的反應物進行了感官評價，進一步研究了木糖和葡萄糖的添加量。反應前后的感官評價進行分析發(fā)現(xiàn)反應產物的鮮味明顯得到增強，腥味和苦味等不好的味道大大減弱，整體風味得到了提升。水解風味得到提升的主要原因在于反應會產生多種風味物質，如酚類、酯類、酮類、醛類、羧酸類及雜環(huán)類等。靳挺等[16]在研究龍頭魚海鮮調味料的制備中，配方以口味純正的咸味調味物食鹽[17]和甜味調味料蔗糖為基料，同時增加了白胡椒粉和姜蒜粉，通過對反應物色澤、香氣和滋味的感官評價發(fā)現(xiàn)香辛料的加入起到了增香、調味的作用。同時各種成分的協(xié)調作用在一定程度上對調味料的風味和口感產生了良好的影響，使得調味料具有純正、自然的魚香味，并且口感鮮美。王浩等[18]以吉富羅非魚魚皮為反應產物進行美拉德反應，分析游離氨基酸的組成和主要風味成分采用的方法是氨基酸自動分析儀和氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，鑒定出5 種主要的風味成分，包括是檸檬烯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、2,3-二羥基丙醛、二乙二醇丁醚醋酸酯等。

關于魚內臟蛋白質方面的研究報道比較少，Bhaskar等[19]優(yōu)化了卡特拉魚內臟蛋白質的水解條件，獲得了氨基酸組成合理的水解物。本研究探索性的將草魚內臟蛋白酶解液與葡萄糖進行美拉德反應，制備出了風味良好的美拉德產物，獲得的最佳反應基本條件為：羰氨物質的量比1∶2、反應溫度110 ℃、反應時間30 min、反應pH 8。通過GC-O-MS對美拉德反應前后香氣化合物成分進行分析，發(fā)現(xiàn)通過美拉德反應可以明顯增加酶解液的風味成分，尤其是香氣活性化合物明顯增多。氣相色譜-嗅聞測定法分析結果主要為油脂味、清新味、甜香味、花香味、燒烤味、焦甜味、花香味、辛辣味、刺激味等。風味物質主要為醛類、酯類、酚類、醇類、吡啶、噻唑等化合物。結合感官評價結果，美拉德反應調味基料的整體滋氣味主要為肉香味、魚香味、油脂味、鮮味、酸味和腥味，因此如何有效降低草魚內臟蛋白水解液美拉德反應調味基料的酸味和腥味將是未來研究的重點內容。本研究結果為美拉德反應在改善魚內臟風味方面的應用提供了理論依據(jù)。

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Preparation of Flavoring Base from Enzymatic Hydrolysate of Visceral Waste Proteins of Grass Carp through Maillard Reaction

CONG Yan-jun, QING Yu-ting, YI Hong
(Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Flavoring base with good flavor was prepared from the papain hydrolysate of visceral waste proteins of grass carp and glucose through Maillard reaction. The optimal reaction conditions were found to be: carbonyl/ammonia molar ratio, 1:2; reaction time, 30 min; temperature, 110 ℃; and pH, 8.0. Gas chromatography-olfactometry mass spectrometry (GC-OMS) was used to detect aroma compounds before and after the thermal reaction. After the reaction, aroma active compounds increased obviously. A total of 19 aroma active compounds were detected, including 3 ketones and aldehydes, 1 ester, 4 furan, 1 pyrazine, 1 thiazole , 2 terpenoids, 2 alkenes , 1 ether, and 1 acid.

grass carp viscera; thermal reaction; flavor

TS205

A

1002-6630（2014）22-0006-05

10.7506/spkx1002-6630-201422002

2014-03-26

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101236）；北京市自然科學基金項目（6132004）；北京市科技新星計劃項目（Z131102000413005）

叢艷君（1978—），女，副教授，博士，研究方向為蛋白質化學與工程。E-mail：cyj_win@sina.com