亳州栽培知母最佳采收期研究

俞年軍，馬義雯，于 嬌，鄭太華，雷學強，陳子海

（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院 現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽合肥 230031；2.安徽海鑫藥業(yè)有限公司，安徽亳州 236800）

亳州栽培知母最佳采收期研究

俞年軍1，馬義雯1，于 嬌1，鄭太華2，雷學強2，陳子海2

（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院 現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽合肥 230031；2.安徽海鑫藥業(yè)有限公司，安徽亳州 236800）

目的 考察亳州栽培知母的最佳采收時間。方法 采用高效液相色譜－紫外光譜法和高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測器測定不同采收期知母中芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量。測定芒果苷的流動相為乙腈－0.1％磷酸水溶液（15∶85），流速為0.8ml／min，柱溫25℃，檢測波長為317nm；測定知母皂苷BⅡ的流動相為乙腈－水（25∶75），流速為1.0ml／min，柱溫25℃；蒸發(fā)光散射檢測器的漂移管溫度為60℃，載氣壓力30 N／cm2。結果 不同采收期知母藥材中芒果苷含量為1.10％～5.28％，知母皂苷BⅡ含量為0.22％～8.68％。結論 11月份是亳州栽培知母的最佳采收期，其芒果苷和知母皂苷含量最高。

知母；高效液相色譜法；芒果苷；知母皂苷；采收期

中藥知母為百合科知母屬多年生草本植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖，具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效，用于煩熱消渴、骨蒸癆熱、肺熱咳嗽、大便燥結、小便不利等癥［1］。在野生知母藥材資源日益減少、不能滿足需求的情況下，栽培知母是藥材的主要來源。安徽亳州是栽培知母的主要產區(qū)之一，大規(guī)模人工栽培已經有30多年的歷史，種植面積每年保持在4～5萬畝。為了了解亳州栽培知母藥材的質量，掌握亳州栽培知母中芒果苷和知母皂苷BⅡ的積累變化規(guī)律，確立亳州知母的最佳采收時間，筆者采用高效液相色譜法研究知母中芒果苷和知母皂苷BⅡ含量的變化規(guī)律，為亳州知母規(guī)范化采收加工提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－20AB型高效液相色譜儀、SPDM20A型檢測器、LC Solution N2010色譜工作站：日本島津；SEDEX 75型蒸發(fā)光散射檢測器：法國Sedere公司；AS－20500A型超聲波清洗器：瑞士Buchi公司。

1.2 試藥 芒果苷（BZP0309）、知母皂苷BⅡ（BZP0338）：由北京華邁科生物技術有限責任公司提供；乙腈為色譜純：美國Tedia試劑公司；水為娃哈哈純凈水：安徽巢湖哇哈哈飲料有限公司；其他試劑為分析純。

1.3 藥材 知母藥材樣品采自安徽省亳州十九里安徽海鑫中藥飲片公司種植基地，2010年3—11月份（1、2、12月份為亳州霜凍期，不易農作）選擇兩年生知母種植地，每月15日定時采挖并予干燥處理。知母藥材經安徽中醫(yī)藥大學中藥與資源教研室劉守金教授鑒定為百合科植物知母A.asphodeloides Bge.的干燥根莖。

2 方法和結果

2.1 芒果苷的含量測定［2－6］

2.1.1 色譜條件：色譜柱為Ultimate XB－C18（250 mm×416mm，5μm）；流動相為乙腈－0.1％磷酸水溶液（15∶85）；流速為0.8ml／min；柱溫為25℃；檢測波長317nm；進樣10μl。

2.1.2 對照品溶液的制備：精密稱取芒果苷對照品適量，加甲醇制成0.270mg／ml的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 供試液溶液的制備：干燥知母藥材粉碎后過30目篩，取粉末0.1g，精密稱定，加入50％乙醇25 ml，浸泡過夜，稱質量，超聲提取40min，補足質量。過濾，取濾液過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 線性關系考察：分別吸取對照品溶液2、4、6、8、10μl注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以芒果苷的峰面積為縱坐標，以芒果苷的質量為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程y＝34 135x－62 056，r＝0.999 8，表明芒果苷在0.540～2.700 μg與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.5 穩(wěn)定性實驗：取同一供試品溶液進行實驗，在2、4、6、8、10h各進1針，每次進樣10μl，測定芒果苷峰面積平均值，結果RSD＝0.834％，表明樣品在10h內穩(wěn)定。

2.1.6 精密度實驗：精密吸取供試品溶液10μl，連續(xù)進樣5次，測定，計算得芒果苷色譜峰峰面積的平均值，RSD＝1.05％。

2.1.7 重復性實驗：取同一批次的知母藥材5份，精密稱定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定芒果苷峰面積平均值，結果RSD＝1.26％。

2.1.8 加樣回收實驗：采用加樣法進行回收率考察。精密稱取0.1g藥材粉末（2010年10月烘干樣品，含量1.25％）3份，分別精密加入芒果苷對照品儲備液1.25、2.50、3.75μg，按照上述方法制備供試液并測定，計算回收率。結果表明高、中、低3個加入量的回收率都較高，平均達到99.26％，結果RSD＝1.90％。

2.1.9 芒果苷含量測定：取知母樣品，按“2.1.3”項的方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件進行測定，以外標法計算含量，測定芒果苷含量的圖譜。見圖1、表1。

圖1 芒果苷對照品（A）、知母樣品（B）高效液相色譜圖

2.2 知母皂苷BⅡ含量測定［7－9］

2.2.1 色譜條件：色譜柱為Ultimate XB－C18（250 mm×416mm，5μm）；流動相為乙腈－水溶液（25∶75）；流速為1.0ml／min；柱溫為25℃，蒸發(fā)光檢測器的漂移管溫度60℃，載氣壓力30N／cm2；進樣20μl。

2.2.2 對照品溶液的制備：精密稱取知母皂苷BⅡ對照品適量，加甲醇－30％乙腈制成0.400mg／ml的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備：干燥知母藥材粉碎后過30目篩。取知母粉末0.2g，加入25ml 70％的乙醇，浸泡過夜，稱質量，超聲提取40min，補足質量。過濾，取濾液過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.2.4 線性關系考察：分別吸取對照品溶液5、10、15、20μl注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以皂苷BⅡ的峰面積的自然對數為縱坐標，以皂苷BⅡ質量的自然對數為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程y＝1.152 8x＋11.133 0，r＝0.999 6，表明皂苷BⅡ在2.00～8.00μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5 穩(wěn)定性實驗：取同一供試品溶液進行實驗，在2、4、6、8、10h各進1針，每次進樣20μl，測定皂苷BⅡ含量平均值，RSD＝2.42％。結果表明樣品在10h內穩(wěn)定。

2.2.6 精密度實驗：精密吸取供試品溶液20μl，連續(xù)進樣5次，測定，計算皂苷BⅡ色譜峰峰面積的平均數，結果RSD＝2.98％。

2.2.7 重復性實驗：取同一批次的知母藥材5份，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定知母皂苷BⅡ含量平均值，結果RSD＝2.22％。

2.2.8 加樣回收實驗：精密稱取0.2g藥材粉末（2010年7月樣品，含量0.22％）5份，分別精密加入知母皂苷BⅡ對照品儲備液20、40、60、80、100 μl，按照上述方法制備供試液并測定，計算回收率。結果表明5個加入量的回收率都較高，平均達到101.4％（RSD＝1.12％）。

2.2.9 知母皂苷BⅡ含量測定：取知母樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以外標法計算含量，測定知母皂苷BⅡ的圖譜和結果見圖2、表1。

圖2 知母皂苷BⅡ對照品（A）、知母樣品（B）高效液相色譜圖

表1 不同采收時間知母藥材中芒果苷和皂苷BⅡ含量（n＝2）

3 討論

由表1可見，從3月份到11月份亳州知母中芒果苷和知母皂苷BⅡ含量呈動態(tài)變化，其中芒果苷和知母皂苷BⅡ在一個生長季中分別出現(xiàn)2個高峰。芒果苷含量高峰出現(xiàn)在7月份和11月份，知母皂苷BⅡ含量高峰出現(xiàn)在3月份和11月份，說明不同采收時間對亳州知母藥材質量有較大的影響。由于5月份為知母地上部分迅速生長期，9月份以后是知母地下增重時間，因此，3月份和7月份不適宜知母的采收，11月份知母中知母皂苷BⅡ和芒果苷含量均高，11月份知母已基本停止生長，所以11月份采收比較適宜。一般認為知母在種植兩年后，選擇春秋二季均可以采收，但結合亳州種植生產實際，12月份、1月份、2月份為亳州最冷時間，農民采挖較難，產地加工不易曬干。綜合考慮，11月份是亳州栽培知母最佳采收時間。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：197.

［2］梁雷，邊寶林，王宏潔.不同產地知母藥材中芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量測定［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（16）：49－51.

［3］陳千良，王文全，馬長華，等.西陵知母中芒果苷的含量動態(tài)研究［J］.中國中藥雜志，2007，32（10）：971－972.

［4］容穗華，林海，高妮.不同產地知母有效成分含量的HPLC法測定［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2011，11（6）：7－9.

［5］梁雷，邊寶林，王宏潔.不同產地知母藥材中芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量測定［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（16）：49－51.

［6］陳千良，孫文基.知母藥材和飲片含量測定修訂研究［J］藥物分析雜志，2010，30（11）：2075－2080.

Study on Best Harvesting Time for Rhizoma Anemarrhenae Cultivated in Bozhou

YU Nian－jun1，MA Yi－wen1，YU Jiao1，ZHENG Tai－h(huán)ua2，LEI Xue－qiang2，CHEN Zi－h(huán)ai2
（1.School of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine ＆Anhui Key Laboratory of Modern Chinese Materia Medica，Anhui Hefei 230031，China；2.Anhui Haixin Pharmaceutical Co.，Ltd.，Anhui Bozhou 236800，China）

Objective To determine the best harvesting time for Rhizoma Anemarrhenae cultivated in Bozhou，China.Methods High－performance liquid chromatography（HPLC）－ultraviolet spectrometry and HPLC－evaporative light－scattering detector（ELSD）were used to determine the content of mangiferin and timosaponin B－Ⅱin Rhizoma Anemarrhenae harvested at different times.For the determination of mangiferin，the mobile phase was acetonitrile－0.1％phosphoric acid（15∶85），with a flow rate of 0.8ml／min；the column temperature was 25℃；the detection wavelength was 317nm.For the determination of timosaponin B－Ⅱ，the mobile phase was acetonitrile－water（25∶75），with a flow rate of 1.0ml／min；the column temperature was 25℃；the drift tube temperature of ELSD was 60℃；the carrier gas pressure was 3.0N／cm2.Results The content of mangiferin and timosaponin B－Ⅱin Rhizoma Anemarrhenae harvested at different times was 1.10％－5.28％and 0.22％－8.68％，respectively.Conclusion The best harvesting time for Rhizoma Anemarrhenae cultivated in Bozhou is in November，when it has the highest content of mangiferin and timosaponin.

Rhizoma Anemarrhenae；high－performance liquid chromatography；mangiferin；timosaponin；harvesting time

R927.2

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.031

2013－07－15）

安徽省科技攻關計劃項目（9010301014）

俞年軍（1965－），男，副教授，碩士