冰茶栓對骨癌痛大鼠不同腦區(qū)亮氨酸腦啡肽和β內(nèi)腓肽含量的影響

嚴繼貴，王迎新，楊宇清，蔡晶晶

（安徽醫(yī)學高等?？茖W校藥學系，安徽合肥 230601）

·實驗研究·

冰茶栓對骨癌痛大鼠不同腦區(qū)亮氨酸腦啡肽和β內(nèi)腓肽含量的影響

嚴繼貴，王迎新，楊宇清，蔡晶晶

（安徽醫(yī)學高等?？茖W校藥學系，安徽合肥 230601）

目的 通過觀察冰茶栓對骨癌痛大鼠不同腦區(qū)亮氨酸腦啡肽（leucine enkephalin，L－EK）和β內(nèi)啡肽（β－endorphin，β－EP）含量的影響，探討其抗骨癌痛的中樞作用機制。方法 取雌性SD大鼠30只，采用W256癌細胞骨髓腔注入術(shù)復制骨癌痛模型。術(shù)后7d選取26只骨癌痛大鼠隨機分為冰茶栓組和模型組，每組13只，另取同期飼養(yǎng)的10只大鼠為正常對照組。術(shù)后15d開始連續(xù)10d給予冰茶栓101mg／kg。分別于手術(shù)前后不同時點測量各組大鼠機械痛閾和熱痛閾；末次給藥后于冰盤取腦，采用放射免疫法檢測各組大鼠大腦皮質(zhì)、丘腦、海馬區(qū)L－EK和β－EP含量。結(jié)果 給藥后5d和10d，冰茶栓可顯著提高骨癌痛大鼠的機械痛閾和熱痛閾（P＜0.05，或P＜0.01）。冰茶栓可明顯提高骨癌痛大鼠丘腦區(qū)L－EK、β－EP含量及海馬區(qū)L－EK含量（P＜0.05，或P＜0.01）。結(jié)論 冰茶栓對W256癌細胞誘導的骨癌痛大鼠具有明顯鎮(zhèn)痛作用，其抗骨癌痛作用的中樞機制可能與其提高部分腦區(qū)的L－EK和β－EP有關(guān)，丘腦和海馬可能是冰茶栓鎮(zhèn)痛作用的靶部位。

冰茶栓；骨癌痛；亮氨酸腦啡肽；β－內(nèi)啡肽

冰茶栓是一種臨床應用多年的浙江省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，該制劑是以江浙蝮蛇毒為主藥，輔以冰片、茶葉、肉桂等制成的中藥復方制劑，主要用途是治療以疼痛為主的阿片類藥物成癮引起的戒斷綜合征，對該制劑的開發(fā)目前已進入Ⅲ期臨床研究階段（國家食品藥品監(jiān)督管理局臨床研究批文：2005L01154）。在臨床應用過程中發(fā)現(xiàn)，該制劑在輔助治療晚期癌痛方面收到良好療效，可大幅度減少重度癌痛患者阿片類止痛藥的使用劑量，對部分輕、中度癌痛患者可單用該制劑治療，且長期使用無依賴性、明顯毒性及不良反應。為了尋找該制劑新的適應證，本課題組對其進行的抗癌痛作用相關(guān)實驗研究結(jié)果表明，該制劑可明顯提高骨癌痛模型大鼠［1］的機械痛閾和熱痛閾，且對骨癌痛大鼠的骨溶解有明顯抑制作用［2］；對其作用機制研究結(jié)果表明，冰茶栓抗癌痛作用與中樞和外周兩種途徑均有關(guān)［35］。本研究旨在通過觀察冰茶栓對骨癌痛大鼠不同腦區(qū)亮氨酸腦啡肽（leucine enkephalin，L－EK）和β內(nèi)啡肽（βendorphin，β－EP）含量的影響，進一步探討該復方制劑抗癌痛的中樞機制及其可能的作用部位。

1 材料

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量160～180g。購自浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心。實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2012－0011。

1.2 實驗藥品與試劑 大鼠用冰茶栓（批號20120209），不含藥空白栓（批號20120210）：均由浙江中醫(yī)藥大學藥學院制劑中心提供；L－EK（批號201203）和β－EP（批號201202）放免試劑盒：北京華英生物研究所；無菌骨蠟：安徽省中醫(yī)院提供；戊巴比妥鈉（批號F20120106）：上?；瘜W試劑公司；注射用慶大霉素（批號12082612）：天津藥業(yè)焦作有限公司。

1.3 實驗用細胞株 W256癌細胞：腹水癌細胞種鼠由浙江醫(yī)學科學院提供，經(jīng)本課題組純化培養(yǎng)所得。

1.4 主要儀器 GC－911型γ放射免疫計數(shù)器：中國科技大學實業(yè)總公司；TGL－40B離心機：上海安亭科學儀器廠；SL2300二氧化碳培養(yǎng)箱：美國Sheldon公司；FLAT－MYM型高頻乳腺攝片機：意大利產(chǎn)；XZC－A型壓力測痛儀：山東醫(yī)學科學院生產(chǎn)；XZC－2B型自控溫度熱板儀：山東醫(yī)學科學院生產(chǎn)。

2 方法

2.1 模型復制與篩選 取SD雌性大鼠30只，參照文獻［1］方法，將大鼠麻醉后在左側(cè)后肢中上端皮膚切開約1.0cm小口，脛骨暴露后，在脛骨中上1／3

處先用7號針頭旋轉(zhuǎn)刺入骨髓腔打孔（適度用力），再用5μl微量注射器抽取3μl約含4×103個W256癌細胞懸液注入骨髓腔，并立即用骨蠟封住針孔，縫合切口，滴撒少許慶大霉素藥液預防感染。手術(shù)后大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7d后，3％戊巴比妥鈉麻醉，置患肢于高頻乳腺攝片機下觀察，選取脛骨上端出現(xiàn)明顯缺損灶的大鼠用作實驗。

2.2 動物分組 選取26只骨癌模型復制成功的大鼠，隨機分為冰茶栓組和模型組，每組13只；另取10只同期飼養(yǎng)的大鼠，以生理鹽水替代W256癌細胞懸液注入骨髓腔作為正常對照組。

2.3 動物給藥 各組大鼠于手術(shù)后第15天開始給藥，每天2次，共10d。其中正常對照組和模型組直腸給予不含藥空白栓；冰茶栓組直腸給予冰茶栓101mg／kg（相當于成人劑量4倍）。

2.4 指標檢測

2.4.1 痛閾測量：各組大鼠分別于手術(shù)前及手術(shù)后第7天、第14天、第19天（給藥第5天）、24天（給藥第10天），采用足趾壓痛法、熱板法測量大鼠機械痛閾和熱痛閾的變化。①機械痛閾測量：將大鼠患肢足掌置于壓力測痛儀壓力針正下方，啟動電動按鈕，使壓力搖桿對大鼠足掌壓力逐漸增強，以嘶叫或縮足為疼痛反應標志，疼痛反應出現(xiàn)時的壓力搖桿質(zhì)量即為機械痛閾，每只大鼠測量2次，并間隔5 min以上，取2次測量均值作為該大鼠的最終機械痛閾。②熱痛閾測量：預先將熱板儀溫度調(diào)至（52± 0.1）℃，將大鼠放置于熱板表面，蓋上頂蓋，以大鼠出現(xiàn)舔后足所需時間作為熱痛閾值，每只大鼠測量2次，每次間隔5min以上，取2次測量均值作為該大鼠的最終熱痛閾。

2.4.2 放射免疫法測定不同腦區(qū)L－EK和β－EP含量：各組大鼠給藥第10天，在末次給藥后進行痛閾測量，隨后脫頸椎處死大鼠，迅速斷頭取下全腦，立即在冰塊上分離出皮質(zhì)、丘腦、海馬，放于Eppendorf管中置沸水浴煮5min，取出稱質(zhì)量后，分別置于玻璃勻漿管內(nèi)，加入1mol／L HCl 1ml，在冰浴中充分勻漿后轉(zhuǎn)入到塑料試管中，室溫放置100min，再加入1mol／L NaOH 1ml用以中和酸，4℃，4 000r／min離心20min，取上清，按照放射免疫試劑盒說明書，采用放射免疫法測定L－EK和β－EP含量。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標準差（±s）”進行統(tǒng)計學描述。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組之間均數(shù)比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 冰茶栓對骨癌痛大鼠痛閾的影響

3.1.1 冰茶栓對骨癌痛大鼠機械痛閾的影響：與正常對照組比較，模型組大鼠在術(shù)后第14天機械痛閾顯著下降（P＜0.01），出現(xiàn)機械痛覺過敏；與模型對照組比較，冰茶栓組大鼠給藥第5天和第10天機械痛閾顯著提高（P＜0.01），提示冰茶栓能明顯提高骨癌痛大鼠的機械痛閾。見表1。

表1 冰茶栓對骨癌痛大鼠機械痛閾的影響（±s）

表1 冰茶栓對骨癌痛大鼠機械痛閾的影響（±s）

注：與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組 別n機械痛域／kg 10d正常對照10 0.296±0.025 0.288±0.023 0.301±0.031 0.31術(shù)前術(shù)后7d術(shù)后14d給藥5d給藥2±0.029 0.308±0.027模 型13 0.303±0.026 0.273±0.024 0.254±0.033＊＊0.225±0.028＊＊0.215±0.029＊＊冰茶栓13 0.302±0.033 0.281±0.023 0.262±0.029＊＊0.401±0.042＊＊＃＃0.383±0.051＊＊＃＃

3.1.2 冰茶栓對骨癌痛大鼠熱痛閾的影響：與正常對照組比較，模型組大鼠在術(shù)后第14天熱痛閾顯著下降（P＜0.01），出現(xiàn)熱痛覺過敏；與模型組比較，冰茶栓組大鼠給藥第5天和第10天熱痛閾顯著提高（P＜0.05，或P＜0.01），提示冰茶栓能明顯提高骨癌痛大鼠的熱痛閾。見表2。

表2 冰茶栓對大鼠熱痛閾的影響（±s）

表2 冰茶栓對大鼠熱痛閾的影響（±s）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組 別n熱痛域／s 10d正常對照10 18.9±4.3 18.2±5.2 18.3±3.9 19.1±3.7 19.6±術(shù)前術(shù)后7d術(shù)后14d給藥5d給藥3.1模 型13 19.2±4.1 17.1±3.2 12.5±3.7＊＊11.5±3.1＊＊10.8±2.6＊＊冰茶栓13 20.1±4.5 17.8±2.3 12.7±4.2＊＊26.5±6.1＊＃＃25.9±5.8＊＃＃

3.2 冰茶栓對骨癌痛大鼠不同腦區(qū)L－EK、β－EP含量的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠丘腦區(qū)L－EK、β－EP含量及海馬區(qū)L－EK含量均顯著降低（P＜0.05，或P＜0.01）；與模型組比較，冰茶栓組

大鼠丘腦區(qū)L－EK、β－EP含量及海馬區(qū)L－EK含量均顯著升高（P＜0.01）。3組皮質(zhì)區(qū)L－EK和β－EP水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，冰茶栓可明顯提高骨癌痛大鼠丘腦區(qū)L－EK、β－EP含量及海馬區(qū)L－EK含量。見表3。

表3 冰茶栓對骨癌痛大鼠不同腦區(qū)L－EK、β－EP含量的影響（±s）

表3 冰茶栓對骨癌痛大鼠不同腦區(qū)L－EK、β－EP含量的影響（±s）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組 別nL－EK／（pg／mg）β－EP／（pg／mg）皮質(zhì)丘腦海馬正常對照10 3.65±1.21 15.13±3.89 11.23±1.32 0.47±0.1皮質(zhì)丘腦海馬2 2.37±1.45 4.38±2.25模 型13 3.58±1.68 11.83±3.41＊7.49±2.53＊＊0.45±0.28 1.23±0.88＊4.13±2.58冰茶栓13 4.26±1.87 19.15±5.10＊＃＃10.89±3.62＃0.61±0.29 6.15±2.82＊5.43±2.37＃＃

4 討論

內(nèi)源性阿片肽是機體內(nèi)主要的鎮(zhèn)痛物質(zhì)。在阿片肽家族中，不同阿片肽類物質(zhì)在鎮(zhèn)痛部位及性質(zhì)上又有所不同。其中，L－EK是δ受體的內(nèi)源性配體，主要分布于下丘腦、海馬、大腦皮質(zhì)、紋狀體及杏仁核等區(qū)域，是腦內(nèi)含量最高的內(nèi)源性神經(jīng)肽，具有廣泛的鎮(zhèn)痛作用［6］。β－EP是μ受體和δ受體的內(nèi)源性配體，是一種由31個氨基酸組成的多肽，它的腦內(nèi)含量遠大于脊髓，廣泛分布于腦內(nèi)各區(qū)，如丘腦、垂體、海馬、大腦皮質(zhì)，具有較強的嗎啡樣活性和鎮(zhèn)痛作用。β－EP的神經(jīng)細胞胞體主要集中于下丘腦－垂體軸中，其纖維通路主要包括弓狀核－邊緣系統(tǒng)、弓狀核－下丘腦、弓狀核－腦干［7－8］。

痛覺的傳遞系統(tǒng)包括3個主要部分，即外周感覺神經(jīng)、脊髓到腦干和丘腦的神經(jīng)細胞網(wǎng)絡(luò)以及丘腦和大腦皮質(zhì)的相互聯(lián)系，包括丘腦、腦橋、中腦在內(nèi)的皮質(zhì)下中樞和大腦皮質(zhì)構(gòu)成了痛覺中樞。其中，丘腦的許多核團對疼痛有著顯著的調(diào)控作用，傳遞痛覺的脊髓丘腦束纖維就終止在丘腦的不同核團上。在這些核團中，含有對傷害性刺激的痛敏神經(jīng)細胞，參與疼痛的興奮或抑制作用。同時，刺激下丘腦的前部、中部、后部和視上核可提高痛閾，產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用。因此，丘腦是疼痛傳遞和調(diào)制中非常重要的整合中樞［9－10］。

本研究旨在前期藥效研究的基礎(chǔ)上，初步探討冰茶栓抗癌痛可能的中樞機制及其作用部位，故而在實驗設(shè)計中僅選擇了藥效研究中鎮(zhèn)痛作用最顯著的101mg／kg單劑量給藥，以避免重復研究。本次研究結(jié)果表明，自手術(shù)后第14天開始，模型大鼠機械痛閾和熱痛閾均顯著下降（P＜0.01），出現(xiàn)明顯的機械痛覺和熱痛覺過敏，該結(jié)果與以往研究結(jié)果［11］相符。而冰茶栓能夠顯著升高W256癌細胞誘導的骨癌痛大鼠機械痛閾和熱痛閾值，顯示出較好的抗癌痛作用。對冰茶栓中樞作用機制研究結(jié)果顯示，冰茶栓可明顯升高骨癌痛大鼠丘腦區(qū)內(nèi)源性L－EK、β－EP含量，對海馬組織的L－EK含量也有升高作用，該結(jié)果表明冰茶栓鎮(zhèn)痛效應的發(fā)揮可能與其對中樞內(nèi)源性阿片肽的調(diào)控有關(guān)。這一點與筆者以往對冰茶栓進行的拆方研究結(jié)果［3］是一致的。調(diào)節(jié)中樞相關(guān)腦區(qū)L－EK、β－EP等內(nèi)源性阿片肽含量，可能是冰茶栓發(fā)揮抗癌痛效應的中樞作用機制之一，其中丘腦與海馬（尤其是丘腦）可能是其發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的靶部位。

由于蛋白質(zhì)和肽類藥物在消化道易被酶所水解，且存在肝臟的首過效應，采用直腸給藥能較好地避免。一般來說，分子量小于5 000Da的小分子不需使用吸收促進劑即可吸收進入體循環(huán)，分子量較大的則較難吸收。冰茶栓是以江浙蝮蛇毒（內(nèi)含大分子多肽）為主藥的復方制劑，該制劑中含有冰片等吸收促進劑，能有效地促進大分子多肽的吸收［12］。相關(guān)研究［13］表明，冰片還有改善血腦屏障通透性的功能，提示冰茶栓中大分子肽類能夠進入中樞起作用與冰片等吸收促進劑有關(guān)。

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Effects of Bingcha Suppository on Content of Leucine Enkephalin andβ－Endorphin in Different Brain Areas of Rats with Bone Cancer Pain

YAN Ji－gui，WANG Ying－xin，YANG Yu－qing，CAI Jing－jing
（Department of Pharmacy，Anhui Medical College，Anhui Hefei 230601，China）

Objective To study the effects of Bingcha Suppository on the content of leucine enkephalin（LEK）andβ－endorphin（β－EP）in different brain areas of rats with bone cancer pain and to investigate its centrally acting mechanism in the treatment of bone cancer pain.Methods Thirty female Sprague－Dawley rats were selected in the study.W256tumor cells were injected into the rat marrow cavity to induce a model of bone cancer pain.At 7days after the operation，26rats with bone cancer pain were randomly divided into Bingcha Suppository group（n＝13）and model group（n＝13）；another 10rats raised during the same period were selected as normal control group.From the 15th day after the operation，the rats in Bingcha Suppository group were given Bingcha Suppository（101mg／kg）for 10days.The mechanical and thermal pain thresholds were measured before and at different time points after the operation.After the last administration，all rats were beheaded and the cerebral cortex，thalamus，and hippocampus were separated from the brain.The content of L－EK andβ－EP in the cerebral cortex，thalamus，and hippocampus were measured by radioimmunoassay.Results On days 5and 10of treatment，the Bingcha Suppository group had significantly increased mechanical and thermal pain thresholds（P＜0.05or P＜0.01）and significantly increased content of L－EK andβ－EP in the thalamus and content of L－EK in the hippocampus（P＜0.05or P＜0.01），as compared with the model group.Conclusion Bingcha Suppository has good analgesic effect in rats with bone cancer pain induced by W256tumor cells.The analgesic mechanism of Bingcha Suppository is probably related to its increasing the content of L－EK andβ－EP in some brain areas，and the thalamus and hippocampus may be the target areas of Bingcha Suppository.

Bingcha Suppository；bone cancer pain；leucine enkephalin；β－Endorphin

R73－36

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.022

2013－12－05）

安徽省高等學校省級優(yōu)秀青年人才

（2010SQRL209）

嚴繼貴（1975－），男，博士，副教授