甲磺酸達(dá)比加群酯膠囊微生物限度檢查方法的建立

賈 雷，王嘉南

（1.淄博職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，山東淄博255015；2.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100875）

甲磺酸達(dá)比加群酯膠囊微生物限度檢查方法的建立

賈 雷1，王嘉南2

（1.淄博職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，山東淄博255015；2.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100875）

目的探討建立甲磺酸達(dá)比加群酯膠囊的微生物限度檢查的方法。方法依據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版（二部）收載的微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果試驗(yàn)表明甲磺酸達(dá)比加群酯膠囊對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用。結(jié)論推薦采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行本品的細(xì)菌計(jì)數(shù)；采用常規(guī)檢驗(yàn)方法進(jìn)行真菌及酵母菌計(jì)數(shù)和控制菌檢查。

甲磺酸達(dá)比加群酯膠囊；微生物限度檢查；方法學(xué)驗(yàn)證

達(dá)比加群酯（dabigatran etexilate，商品名Pradaxa）是一種新型非肽類(lèi)直接凝血酶抑制劑，由德國(guó)勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）公司研發(fā)。甲磺酸達(dá)比加群酯膠囊是一種新型口服抗凝藥物，通過(guò)在體內(nèi)直接抑制凝血酶起到抗凝作用［1］，臨床用于非瓣膜房顫患者的卒中和全身栓塞預(yù)防［2，3］，具有口服、強(qiáng)效、無(wú)需特殊用藥監(jiān)測(cè)、藥物相互作用少、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)［4］。在建立甲磺酸達(dá)比加群酯膠囊的微生物限度檢查方法過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，在對(duì)其進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，需要消除其抑菌活性再進(jìn)行試驗(yàn)。我們依據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版（二部）［5］收載的微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則，對(duì)甲磺酸達(dá)比加群酯膠囊微生物限度檢查進(jìn)行了方法學(xué)研究，建立了該品種的微生物限度檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 MJX－251B－Z型真菌培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BPX－162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；YXQ－LS－70A型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HR40－Ⅱ－B2生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司）；ZH－2型渦旋混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。

1.2 試藥 甲磺酸達(dá)比加群酯膠囊（自制，批號(hào)：131201、131202、131203）；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁液體培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（F）44102］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillusniger）［CMCC（F）98003］（山東省食品藥品檢驗(yàn)所提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 取經(jīng)35℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物各1 mL，分別用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)渲薪瘘S色葡萄球菌稀釋至10－7、枯草芽孢桿菌稀釋至10－5、大腸埃希菌稀釋至10－7，做活菌計(jì)數(shù)備用。

取經(jīng)26℃培養(yǎng)24 h的白色念珠菌改良馬丁液體培養(yǎng)物1 mL，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10－5，做活菌計(jì)數(shù)備用。

取經(jīng)26℃培養(yǎng)10 d的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將黑曲霉孢子洗脫，吸取出孢子懸液1 mL，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10－4，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.2 菌液的檢驗(yàn) 取上述金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的稀釋液各1 mL，用45℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20 mL注皿，各平行測(cè)定兩皿，35℃培養(yǎng)3 d，逐日觀察計(jì)數(shù)，應(yīng)約為50～100 CFU·mL－1。

取上述白色念珠菌稀釋液及黑曲霉菌孢子混懸液各1 mL，用45℃琥紅瓊脂培養(yǎng)基20 mL注皿，各平行測(cè)定兩皿，26℃培養(yǎng)5 d，逐日觀察計(jì)數(shù)，應(yīng)約為50～100 CFU·mL－1。

2.3 供試液制備 取樣品10 g，置研缽中，加入45℃含10%聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液適量，研磨均勻，稀釋至200 mL，混勻，作為1∶20的供試液。

2.4 細(xì)菌、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.4.1 常規(guī)法（1 mL／皿、0.5 mL／皿、0.2 mL／皿）

試驗(yàn)組：取1∶20供試液1、0.5或0.2 mL和“2.1”項(xiàng)下制備的菌液1 mL，用45℃培養(yǎng)基20 mL注皿，各平行測(cè)定兩皿，35℃或26℃培養(yǎng)2～5 d，逐日觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)。

菌液組：測(cè)定每一菌株所加的試驗(yàn)菌數(shù)（同菌液檢驗(yàn)）。

供試品對(duì)照組：取1∶20供試液1、0.5或0.2 mL，用45℃培養(yǎng)基20 mL注皿，各平行測(cè)定兩皿，35℃或26℃培養(yǎng)2～5 d，逐日觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)。

2.4.2 薄膜過(guò)濾法（200 mL／膜） 試驗(yàn)組：取1∶20供試液1 mL置于含0.1%蛋白胨溶液50 mL的微生物限度檢查無(wú)菌過(guò)濾器中，用0.1%蛋白胨溶液沖洗，每次100 mL，共200 mL，在最后一次沖洗液中加入50～100 CFU試驗(yàn)菌，取出濾膜貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)2～3 d，逐日觀察，計(jì)數(shù)。

菌液組：測(cè)定每一菌株所加的試驗(yàn)菌數(shù)（同菌液檢驗(yàn)）。

供試品對(duì)照組：取1∶20供試液1 mL置于含0.1%蛋白胨溶液50 mL的微生物限度檢查無(wú)菌過(guò)濾器中，用0.1%蛋白胨溶液沖洗，每次100 mL，共200 mL，取出濾膜貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)2～3 d，逐日觀察，計(jì)數(shù)，作為供試品本底菌數(shù)。

2.4.3 回收率計(jì)算 按如下公式計(jì)算試驗(yàn)組的加菌回收率：為該株陽(yáng)性菌的回收率。試驗(yàn)組的加菌

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表1～4。

表1 平皿法（1 mL／皿）驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表1結(jié)果可以看出：3批供試品接種5株陽(yáng)性試驗(yàn)菌株進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，采用平皿法（1 mL／皿）時(shí)，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的平均回收率小于70%，說(shuō)明有抑菌活性，細(xì)菌計(jì)數(shù)需要采用平皿法（0.5 mL／皿）繼續(xù)驗(yàn)證；白色念珠菌和黑曲霉的平均回收率均大于70%，說(shuō)明無(wú)抑菌活性，可以采用平皿法（1 mL／皿）進(jìn)行真菌及酵母菌計(jì)數(shù)。

表2 平皿法（0.5 mL／皿）驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表2結(jié)果可以看出：采用平皿法（0.5 mL／皿）時(shí)，3批供試品枯草芽孢桿菌的平均回收率小于70%，說(shuō)明有抑菌活性，細(xì)菌計(jì)數(shù)需要采用平皿法（0.2 mL／皿）繼續(xù)驗(yàn)證。

表3 平皿法（0.2 mL／皿）驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表3結(jié)果可以看出：采用平皿法（0.2 mL／皿）時(shí)，3批供試品枯草芽孢桿菌的平均回收率仍然小于70%，說(shuō)明有抑菌活性，細(xì)菌計(jì)數(shù)需要采用薄膜過(guò)濾法繼續(xù)驗(yàn)證。

表4 薄膜過(guò)濾法（200 mL／膜）驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表4結(jié)果可以看出：采用薄膜過(guò)濾法（200 mL／膜）時(shí)，3批供試品枯草芽孢桿菌的平均回收率均大于70%，說(shuō)明沒(méi)有抑菌活性，可以采用薄膜過(guò)濾法（200 mL／膜）進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

2.5 大腸埃希菌檢查方法的驗(yàn)證 試驗(yàn)組：取1：20供試液20 mL加入到100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，同時(shí)加入“3.1菌液制備”項(xiàng)下制備的大腸埃希菌液1 mL，置35℃培養(yǎng)24 h；取增菌液0.2 mL加入到5 mLMUG培養(yǎng)基的試管中，置35℃培養(yǎng)，于5、24 h在366 nm紫外線下觀察，觀察后沿管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液觀察結(jié)果記錄。

供試品對(duì)照組：取1∶20供試液20 mL加入到100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)24 h；取增菌液0.2 mL加入到5 mLMUG培養(yǎng)基的試管中，置35℃培養(yǎng)，于5、24 h在366 nm紫外線下觀察，觀察后沿管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液觀察結(jié)果記錄。

表5 大腸埃希菌常規(guī)法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表5結(jié)果可以看出，3批供試品接種大腸埃希菌進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)組均能檢出大腸埃希菌，而供試品對(duì)照組未檢出大腸埃希菌，可以采用該方法進(jìn)行大腸埃希菌的檢查。

3 討論

在日常藥品檢驗(yàn)工作中，各級(jí)藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對(duì)微生物限度檢查做了大量的方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)［6～8］，建議在國(guó)家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)收錄經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的微生物限度檢查的具體方法，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享，減少重復(fù)工作量。

對(duì)口服制劑中微生物污染狀況的控制均是各國(guó)藥品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)［9，10］。當(dāng)藥品本身具有抗菌活性時(shí)，應(yīng)首先消除其抗菌活性，才能保證檢驗(yàn)結(jié)果的有效性［9］。甲磺酸達(dá)比加群酯膠囊對(duì)枯草芽孢桿菌具有抑制作用，枯草芽孢桿菌作為敏感菌株，可以被選擇用作該藥品微生物限度檢查的陽(yáng)性試驗(yàn)菌株，這將大大提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，推薦甲磺酸達(dá)比加群酯膠囊微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)方法如下：取樣品10 g，置研缽中，加入45℃含10%聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液適量，研磨均勻，稀釋至200 mL，混勻，作為1∶20的供試液。取1∶20的供試液1 mL，采用薄膜過(guò)濾法（200 mL／膜）進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)的檢查，采用平皿法（1 mL／皿）進(jìn)行真菌及酵母菌計(jì)數(shù)的檢查；取1∶20的供試液20mL，采用常規(guī)法進(jìn)行大腸埃希菌的檢查。

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The establishment ofm icrobial lim it testmethod of Dabigatran Etexilate M esylate Capsules

JIA Lei1，WANG Jia-nan2
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Zibo Vocational Institute，Zibo 255015，China；2.School of Life Sciences，Beijing Normal University，Beijing 100875，China）

ObjectiveTo establish amethod ofmicrobial limit test for Dabigatran Etexilate Mesylate Capsules.M ethodsValidation ofmicrobiological limit tests according to Chinese Pharmacopoeia edition 2010.ResultsDabigatran Etexilate Mesylate Capsules has strong inhibiting effect on Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus in bacterium.ConclusionThe membrane filtrationmethod was used in the test of bacterium.The routinemethod was used in the test ofmold and yeasts.The routinemethod was used in the test of pathogenic bacterium.

Dabigatran Etexilate Mesylate Capsules；Microbial limits test；Validation

R927.11

A

2095－5375（2014）10－0589－003

賈雷，男，副教授，研究方向：藥理學(xué)，E－mail：jleizb＠163.com