廣西茅尾海牡蠣天然種苗種類鑒定和群體組成的初步分析

鐘方杰, 嚴雪瑜 高 揚 蔣欽楊 賈 崢 李瓊珍, 李文紅 陳 琴

(1. 廣西大學 動物科學技術(shù)學院, 廣西 南寧 530004; 2. 廣西水產(chǎn)研究所, 廣西 南寧 530021)

廣西茅尾海牡蠣天然種苗種類鑒定和群體組成的初步分析

鐘方杰1,2, 嚴雪瑜1, 高 揚1, 蔣欽楊1, 賈 崢1, 李瓊珍2, 李文紅1, 陳 琴1

(1. 廣西大學 動物科學技術(shù)學院, 廣西 南寧 530004; 2. 廣西水產(chǎn)研究所, 廣西 南寧 530021)

了解廣西茅尾海牡蠣種質(zhì)資源現(xiàn)狀, 有助于提高牡蠣采苗效果。通過在茅尾海采集常見 5種牡蠣成體, 并在牡蠣不同繁殖高峰期分別采集牡蠣D型幼蟲DⅠ、DⅡ, 在不同附著期分別采集牡蠣幼苗MⅠ、MⅡ、MⅢ, 采用多重PCR技術(shù)對牡蠣成體、稚貝及幼蟲進行種類鑒定。香港巨牡蠣(Crassostrea hongkongensis)在茅尾海牡蠣稚貝和幼蟲高峰期均屬于優(yōu)勢種; 稚貝中香港巨牡蠣、有明巨牡蠣(Crassostrea ariakensis)和熊本牡蠣(Crassostrea sikamea) 3個種類的平均比例分別為 88.3%、6.7%和5.0%, 香港巨牡蠣與熊本牡蠣、有名巨牡蠣相比差異顯著(P＜0.05), 熊本牡蠣與有明巨牡蠣差異不顯著(P＞0.05)。香港巨牡蠣是茅尾海牡蠣優(yōu)勢種, 7月12日之前投放采苗器可采集到數(shù)量多、種類單一的香港巨牡蠣。7月12日之后投放采苗器, 附著的稚貝中有明巨牡蠣和熊本牡蠣比例增加, 影響采苗效果及養(yǎng)殖生產(chǎn)。

茅尾海; 牡蠣稚貝;D型幼蟲; 多重PCR;COⅠ基因

廣西欽州是中國牡蠣之鄉(xiāng), 欽州茅尾海是國家級海洋公園保護區(qū), 也是廣西牡蠣養(yǎng)殖基地和中國最大的牡蠣天然采苗區(qū)[1]。茅尾海牡蠣養(yǎng)殖戶通過每年 6月(農(nóng)歷)向海區(qū)投放水泥球片采苗器采集牡蠣天然苗, 最高年產(chǎn)牡蠣苗種約 1000億粒, 對廣西、廣東、福建和海南等地牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)有重要貢獻[2]。當?shù)仞B(yǎng)殖戶根據(jù)牡蠣的貝殼外形、外套膜顏色和閉殼肌痕顏色將茅尾海牡蠣分為 5個種, 俗稱分別為“白眼蠔”、“紅眼蠔”、“蠔礪”、“黑眼蠔”、“黃蠔”; 有關(guān)茅尾海天然牡蠣種質(zhì)資源報道很少。茅尾海采苗區(qū)牡蠣幼蟲數(shù)量監(jiān)測發(fā)現(xiàn), 每年有 4～5個可以投放采苗器的牡蠣幼蟲高峰期; 雖然不同種牡蠣存在繁殖期不同的生殖隔離現(xiàn)象[3], 由于同種牡蠣具有分批產(chǎn)卵的繁殖特性, 導致無法準確判斷茅尾海香港巨牡蠣幼蟲高峰期出現(xiàn)次數(shù)和時間, 采苗效果受到影響, 不利于茅尾海牡蠣資源的保護以及合理開發(fā)利用。

結(jié)合生物形態(tài)學分類與分子生物技術(shù)的方法已成為鑒定牡蠣品種最為有效和廣泛應用的方法之一[4]。Wang等[5]利用多重PCR 技術(shù)有效區(qū)分了巨蠣屬的5個物種。近年基因測序、系統(tǒng)進化樹分析等分子技術(shù)的發(fā)展, 已鑒定證實華南沿海的“白肉蠔”為香港巨牡蠣(C.hongkongensis), “紅肉蠔”為日本有明巨牡蠣(C. ariakensis)[6]; “赤蠔”可能是一個新種, 而“白蠔”含有香港巨牡蠣和有明巨牡蠣2個物種[2]。2010年宋忠魁等[7]的分子鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣西茅尾海 3種常見牡蠣分別是“白眼蠔”香港巨牡蠣、“紅眼蠔”有明巨牡蠣、“蠔礪”熊本牡蠣(C.sikamea), 其中香港巨牡蠣是茅尾海主要養(yǎng)殖品種。李詠梅等[8]通過序列特征、遺傳距離和系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明, COⅠ 基因可用于牡蠣的種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析。以上研究結(jié)果表明COⅠ條形碼技術(shù)和基于COⅠ條形碼技術(shù)發(fā)展的PCR-RFLP及多重PCR等技術(shù)能對一些牡蠣種類進行快速鑒定。

本研究根據(jù)現(xiàn)有的成體牡蠣 COⅠ條形碼標記和PCR分子標記, 對茅尾海養(yǎng)殖戶提供的5種成體牡蠣, 以及不同牡蠣繁殖高峰期采集的牡蠣 D型幼蟲和相應高峰期附著的稚貝進行種類鑒定, 以查明茅尾海牡蠣的種類和組成等種質(zhì)資源情況, 為提高茅尾海牡蠣半人工采苗預報技術(shù)和制訂養(yǎng)殖規(guī)劃提供科學參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 成體牡蠣的采集

試驗所用的5個種類成體牡蠣由欽州茅尾海養(yǎng)殖戶提供, 分別編號為樣品 A、B、C、D、E。每個種類隨機選取樣本各10個, 分別采集貝殼肌40 mg于1.5 mL 離心管中, 經(jīng)液氮處理后, ?40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 牡蠣D形幼蟲的采集

采樣地點設在欽州茅尾海牡蠣采苗區(qū)(21°49.354′N, 108°33.065′E), 采樣方法參照《海洋漁業(yè)調(diào)查規(guī)范》[9]。2012年7月3日和7月13日牡蠣繁殖高峰期分別采集水樣, 水樣濃縮后, 將不同牡蠣繁殖高峰期D型幼蟲記為DⅠ、DⅡ; 在解剖顯微鏡下分離單個D型幼蟲, 各40個移入0.2 mL PCR管中, 加入2 μL無水乙醇固定, –40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 牡蠣稚貝的采集

2012年11月初在欽州沙井養(yǎng)蠔專業(yè)合作社茅嶺江牡蠣保苗區(qū)隨機抽取6月8～10日、7月3～5日、7月 12～15日幼蟲高峰時附著的牡蠣稚貝; 各期分別隨機選取牡蠣稚貝40個, 記為MⅠ、MⅡ、MⅢ, 所選牡蠣稚貝平均殼高和殼長分別為2.03 cm和1.78 cm;采集去除內(nèi)臟的軟體部置于1.5 mL離心管中, 經(jīng)液氮處理后, ?40℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼灅悠吩斠姳?。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取

牡蠣稚貝、牡蠣D型幼蟲總DNA提取分別按FOREGENE公司的Genomic DNA Isolation Kit 和Genomic DNA Micro Kit操作。

1.2.2 引物的設計與合成

根據(jù)Folmer[10]開發(fā)的線粒體基因組COⅠ基因通用引物, 設計外引物LCO-1490和HCO-2198, 參照WANG[5]設計的Chk、Car、Csi作為多重PCR特異性內(nèi)引物, 并送至上海生工生物工程有限公司進行合成。引物序列如表2所示。

1.2.3 通用引物PCR擴增

PCR反應體系: CWBIO生物公司 Taq Master Mix酶(Taq DNA Polymerase、Taq PCR Buffer、Mg2+、dNTP mix)7.5 μL, 成體牡蠣DNA模板2 μL, 通用引物(LCO、HCO)終濃度為0.6 μmol/L, 補足滅菌雙蒸蒸餾水至15 μL。

表1 試驗樣品Tab.1 The test samples

表2 PCR引物序列Tab.2 The PCR primer sequences

PCR反應程序: 94 ℃預變性2 min, 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 30個循環(huán), 72 ℃后延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙錠(EB)染色, 用凝膠圖像及分析系統(tǒng)觀察、照相。將5個種類牡蠣擴增得到的PCR產(chǎn)物分別送至深圳華大基因生物公司和英駿(上海)生物技術(shù)有限公司進行序列測定。

1.2.4 多重PCR鑒定

參照Wang[5]牡蠣鑒定多重PCR技術(shù)鑒別采集到的牡蠣成體、稚貝和分離得到的單個 D型幼蟲, 并對所得結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

多重PCR反應體系: Taq Master Mix酶7.5 μL, DNA模板2 μL, 兩條外引物(LCO、HCO)終濃度為0.8 μmol/L, 3條特異性內(nèi)引物(Car、Chk、Csi)終濃度為0.2 μmol/L, 補足滅菌雙蒸蒸餾水至15 μL。

PCR反應程序同1.2.3。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙錠(EB)染色, 用凝膠圖像及分析系統(tǒng)觀察、照相。陰性對照組用滅菌雙蒸蒸餾水代替模板DNA。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及序列分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計, 用DNASTAR7.1軟件進行序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 成體牡蠣多重PCR和測序結(jié)果

2.1.1 多重PCR結(jié)果

用兩條通用外引物和 3條特異性內(nèi)引物對成體牡蠣進行多重 PCR鑒定, 兩條外引物在所有品種中均擴增得到大小約700 bp的片段, 而特異性引物僅在該品種中得到擴增; 電泳檢測結(jié)果如圖1所示。檢測結(jié)果顯示: 俗稱“白眼蠔” 和“黑眼蠔”的樣品A和D擴增出現(xiàn)香港巨牡蠣(C.hongkongensis) 387 bp特異目的片段; 俗稱“紅眼蠔”樣品 B擴增得到有明巨牡蠣(C. ariakensis)183 bp特異目的片段; 俗稱“蠔礪”和“黃蠔”的樣品 C和 E擴增出現(xiàn)熊本牡蠣(C.sikamea)546 bp特異目的片段。說明“紅眼蠔” 是有明巨牡蠣, “白眼蠔”和“黑眼蠔” 是香港巨牡蠣,“蠔礪” 和“黃蠔”是熊本牡蠣。

2.1.2 通用引物PCR擴增及測序結(jié)果

用通用引物LCO-1490 和HCO-2198, 對5種成體牡蠣進行PCR擴增, 將PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳, 結(jié)果如圖 2所示, 可見大小約 700 bp的條帶, 與預期目的片段大小一致。

圖1 5種成體牡蠣多重PCR擴增結(jié)果Fig.1 Multiplex-PCR results of five oyster adults

圖2 成體牡蠣通用引物PCR擴增結(jié)果Fig.2 Universal primers-PCR results of oyster adults

2.1.2.1 同源性結(jié)果分析:

將A、B、C、D、E 5個樣品測序得到的序列與NCBI上GenBank公布的幾種牡蠣COⅠ基因部分序列用DNASTAR 7.1軟件進行比對, 其中包括香港巨牡蠣(C.hongkongensis) (AY632556.1、FJ841963.1)、有明巨牡蠣(C. ariakensis)(AY632564、FJ841964.1)、熊本牡蠣(C.sikamea)(HQ661011、FJ841966.1)、長牡蠣(C.gigas)(AF152565.1、AF177226.1)、日本巨牡蠣(C.nippona)(AF300616.1、HM015198.1)、葡萄牙牡蠣(C.angulata)(AF152567、FJ841965.1)、美洲牡蠣(C.virginica)(AY905542)、歐洲平牡蠣(O.edulis) (AF120651.1)、黑齒牡蠣(Saccostrea mordax)(FJ841-968.1)、西班牙牡蠣(Crassostreasp.DB1)(JQ0609-58.1)。同源性分析結(jié)果顯示: A、D與香港巨牡蠣的同源性分別為99.8%、100.0%; B與有明巨牡蠣的同源性為99.8%; C、E與熊本牡蠣同源性分別為99.8%、99.2%, 其進化關(guān)系分析結(jié)果見圖3。

2.1.2.2 測序結(jié)果分析:

將 PCR產(chǎn)物測序得到的結(jié)果與通用引物 LCO-1490和 HCO-2198序列進行拼接, 得到 5個樣品COⅠ基因部分序列結(jié)果如圖4所示。

綜上所述, 序列分析結(jié)果與多重PCR結(jié)果一致,樣品B為有明巨牡蠣, 樣品A和D為香港巨牡蠣, 樣品C和E為熊本牡蠣。廣西茅尾海成體牡蠣種類共3種, 結(jié)果與宋忠魁的研究結(jié)果一致。而樣品A與D、C與 E在形態(tài)上的差異可能是由于一些環(huán)境因素或者其它形態(tài)上的主效基因的不同所致。

圖3 試驗獲得的5個樣品COⅠ基因部分序列與其他品種牡蠣序列的進化關(guān)系Fig.3 Phylogenetic tree of COⅠgene sequences of five test samples and other species of oyster

2.2 牡蠣D型幼蟲多重PCR鑒定結(jié)果

牡蠣D型幼蟲多重PCR鑒定結(jié)果顯示: DⅠ高峰期所檢測的40個D型幼蟲中, 共檢測出39個香港巨牡蠣, 特異目的片段大小為387 bp; 1個為有明巨牡蠣, 片段大小為183bp, 經(jīng)統(tǒng)計得到DⅠ期中香港巨牡蠣所占的比例為 97.5%, 有明巨牡蠣的比例為2.5%, 而熊本牡蠣則為0。DⅡ高峰期40個D型幼蟲的檢測結(jié)果為所檢幼蟲100%為香港巨牡蠣。統(tǒng)計結(jié)果如圖5所示, 兩個幼蟲高峰期中, D型幼蟲的種類以香港巨牡蠣為優(yōu)勢種。

2.3 牡蠣稚貝多重PCR鑒定結(jié)果

牡蠣稚貝多重 PCR鑒定結(jié)果顯示: MⅠ牡蠣稚貝中香港巨牡蠣36個, 占90%, 有明巨牡蠣3個, 占7.5%, 熊本牡蠣1個, 占2.5%; MⅡ牡蠣稚貝中香港巨牡蠣39個, 占97.5%, 有明巨牡蠣1個, 占2.5%; MⅢ牡蠣稚貝中香港巨牡蠣31個, 占77.5%, 有明巨牡蠣4個, 占10.0%, 熊本牡蠣5個, 占12.5%。詳見圖6。

由圖 6可知, 在不同幼蟲高峰期附著得到的牡蠣稚貝MⅠ、MⅡ、MⅢ中香港巨牡蠣、有明巨牡蠣、熊本牡蠣均有出現(xiàn), 香港巨牡蠣、有明巨牡蠣和熊本牡蠣3個種平均比例分別占88.3%、6.7%和5%; 通過配對樣本t檢驗得到, 香港巨牡蠣與熊本牡蠣、有明巨牡蠣相比差異顯著(P＜0.05), 熊本牡蠣與有明巨牡蠣差異不顯著(P＞0.05)。由此得出: 牡蠣各繁殖期附著得到的稚貝均以香港巨牡蠣為優(yōu)勢種。

3 討論

3.1 廣西茅尾海常見牡蠣種類鑒定

目前, 關(guān)于我國沿海牡蠣的命名及分類是研究討論的熱點[11], Lam等[12]2003年通過分子系統(tǒng)學和形態(tài)學分析將舊稱“近江牡蠣”(O. rivrlaris)重新訂名為香港巨牡蠣(C.hongkongensis); 宋忠魁等[7]根據(jù)COⅠ條形碼技術(shù)對成體養(yǎng)殖牡蠣鑒定, 推定香港巨牡蠣是欽州灣茅尾海優(yōu)勢種類, 并指出俗名“白眼蠔”為香港巨牡蠣, “紅眼蠔”為有明巨牡蠣, “蠔礪”則為熊本牡蠣。廣西茅尾海養(yǎng)殖的“黑眼蠔”的外部形態(tài)與“白眼蠔”相似, 但閉殼肌痕顏色較深, “蠔礪” 和“黃蠔”外套膜顏色相近, 但外殼邊緣為“菊花”狀, 而“黃蠔”外殼則狹長型。本實驗序列分析與多重 PCR結(jié)果說明“紅眼蠔”是有明巨牡蠣, “白眼蠔”和“黑眼蠔”是香港巨牡蠣, “蠔礪”和“黃蠔”是熊本牡蠣, 廣西茅尾海成體牡蠣種類共3種, 與宋忠魁等[7]的研究結(jié)果一致?！鞍籽巯枴迸c“黑眼蠔”、“蠔礪”與“黃蠔”可能分別是同一物種的不同品系, 它們在形態(tài)上的差異可能是由于一些環(huán)境因素或者其他形態(tài)上的主效基因的不同所致。牡蠣外部形態(tài)大小、外套膜顏色和閉殼肌痕顏色可作為表形性狀用于品種選育評價,但作為種類鑒定標準依據(jù)不足。

3.2 廣西茅尾海牡蠣苗種的種類組成分析

在南海海區(qū), 牡蠣的采苗一年可出現(xiàn)兩次附著高峰, 夏秋各一次。因為夏苗比秋苗數(shù)量多、體質(zhì)壯、生長快, 生產(chǎn)上一般都采用夏苗[13]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)茅尾海7月份發(fā)生的D型幼蟲中香港巨牡蠣占97.5%以上, 分別在6月和7月初附著的稚貝MⅠ、MⅡ中香港巨牡蠣占90%以上, 說明6月和7月初海區(qū)的D型幼蟲高峰期中香港巨牡蠣屬于優(yōu)勢種, 茅尾海大規(guī)模的養(yǎng)殖牡蠣是采苗區(qū)幼蟲的主要來源; 7月12日之前投放采苗器可采集到數(shù)量多、種類純的香港巨牡蠣。7月 12日之后投放采苗器, 香港巨牡蠣以外的牡蠣附著量增加, 影響采苗效果及養(yǎng)殖生產(chǎn)。蘇天鳳等[2]研究結(jié)果認為, 欽州灣養(yǎng)殖的“白蠔”種群含有有明巨牡蠣和香港巨牡蠣 2個種, 其中有明巨牡礪所占比例約為27%。本實驗6月和7月附著的3批稚貝中香港巨牡蠣、有明巨牡蠣和熊本牡蠣 3個種平均分別為88.3%、6.7%和5%, 結(jié)果與宋忠魁等[7]認為有明巨牡蠣和熊本牡蠣分別占茅尾海常見養(yǎng)殖牡蠣的5%相似, 但有明巨牡蠣所占比例低于蘇天鳳等得到的 27%的結(jié)果。這可能與漁民在牡蠣養(yǎng)成過程中有意剔除肉質(zhì)較差的“紅眼蠔”和個體小的“黃蠔”, 養(yǎng)殖群體中香港巨牡蠣比例逐年增加有關(guān)。

圖4 5個樣品COⅠ基因部分序列Fig.4 Partial sequences of CO Ⅰgene of five sa mples

4 結(jié)論

本研究對廣西茅尾海常見的幾個種類的牡蠣,利用 COⅠ序列分析進行了分子鑒定, 同時, 針對 D型幼蟲和不同采苗期的牡蠣稚貝進行了鑒定和區(qū)分,推定香港巨牡蠣始終是該海區(qū)的優(yōu)勢種, 并初步了解牡蠣不同繁殖期苗種種類資源, 為提高牡蠣半人工采苗效果提供理論依據(jù)。

圖5 牡蠣D型幼蟲DⅠ、DⅡ多重PCR統(tǒng)計結(jié)果Fig.5 The multiplex-PCR statistical results of oyster larvae DⅠand DⅡ

圖6 牡蠣幼苗MⅠ、MⅡ、MⅢ多重PCR統(tǒng)計結(jié)果Fig.6 The multiplex-PCR statistical results of oyster juvenile MⅠ, MⅡ and MⅢ

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(本文編輯: 梁德海)

Species identification species group structure analysis of the common oysters from the Maowei sea in Guangxi

ZHONG Fang-jie1,2, YAN Xue-yu1, GAO Yang1, JIANG Qing-yan1, JIA Zheng1, LI Qiong-zhen2, LI Wen-hong1, CHEN Qin1
(1. College of Animal Science and Technology of Guangxi University, Nanning 530004, China; 2. Guangxi Institute of Fisheries , Nanning 530021, China)

Jun., 22, 2013

Maowei Sea; oyster juvenile; oyster larvae; multiple PCR; cytochrome coxidase I gene

The present study was conducted to learn the germplasm resource situation of oyster larvaes and juveniles in Guangxi Maowei Sea, to improve the efficiency of oysters collecting. Five common oyster adults were collected from Maowei Sea, Two types of oyster D type larvae, named DⅠand DⅡwere collected during different breeding peaks of mature oysters. Three types of oyster juvenile, named MⅠ, MⅡand MⅢ were collected, during different attachment periods. Multiple PCR technology was used to identify the species of the oyster adults, juvenile and larvae.C.hongkongensiswas the dominant species in breeding peaks of both mature oysters and oyster juvenile. The average proportion was 88.3%, 6.7% and 5% forC.hongkongensis,C. ariakensisandC.sikamearespectively in oyster juvenile. The quantity ofC.hongkongensiswas significant higher than that of C.sikamea and C. ariakensis(P＜0.05). There was no significant difference betweenC.sikamea and C. ariakensis (P＞0.05).C.hongkongensiswas the dominant oyster in Maowei sea. In order to collect numerousC.hongkongensiswith single species, oyster collectors should be placed before July 12.Otherwise, the proportion of oyster juvenile which adheresC. ariakensisandC.sikameawould increase, which would influence the collection and aquaculture production of Oyster.

S93

A

1000-3096(2014)03-0091-07

10.11759/hykx20130204003

2013-06-22;

2013-10-11

廣西科技攻關(guān)項目(桂科攻13470002-1); 廣西科技攻關(guān)項目(桂科攻11107012-2); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項; 廣西碩士研究生科研創(chuàng)新項目; 廣西高校大學生創(chuàng)新計劃項目

鐘方杰(1988-), 男, 廣西欽州人, 碩士研究生, 研究方向:漁業(yè), 電話: 13768372701, E-mail:zhongyu0713@126.com; 李文紅, 通信作者, 教授, 電話: 15994479761, E-mail: whli66@163.com; 陳琴, 通信作者, 高級實驗師, 電話: 18934721306, E-mail: c90757@sina.com