蜂毒素治療肝癌的機制及相關(guān)制劑研究進展

劉淑君，楊 勇，傅繼華

（1.中國藥科大學藥學院，江蘇南京211198；2.中國藥科大學藥物研究院，江蘇南京211198）

·綜 述·

蜂毒素治療肝癌的機制及相關(guān)制劑研究進展

劉淑君1，楊 勇2，傅繼華1

（1.中國藥科大學藥學院，江蘇南京211198；2.中國藥科大學藥物研究院，江蘇南京211198）

蜂毒素作為蜂毒的主要組成成分和活性單位，是由26個氨基酸殘基組成的堿性多肽，具有抗菌、抗關(guān)節(jié)炎、鎮(zhèn)痛、抗輻射等廣泛的生物學功能；近年來蜂毒素的抗腫瘤作用受到越來越多的關(guān)注和研究。本篇對蜂毒素抑制肝癌發(fā)展進程中誘導肝癌細胞凋亡、抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和抗血管生成，調(diào)節(jié)免疫等機制研究，以及針對蜂毒素肽存在過敏反應、溶血等副作用進行減毒增效的改造研究作一綜述，旨在探討蜂毒素治療肝癌的機制及可能應用于臨床的制劑類型。

蜂毒素；肝癌；機制；減毒增效

蜂毒（Bee venom）是工蜂毒腺和附腺分泌出的具有芳香氣味的一種透明毒液，在其受到侵犯時由螫針排出。我國數(shù)千年以前就開始應用蜂蟄療法治療風濕、類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、腰椎頸椎病和多發(fā)性硬化癥等疾?。?～4］。近年來，蜂毒對腫瘤的治療作用受到越來越多的關(guān)注和研究。江蘇省中醫(yī)院，鹽城市中醫(yī)院等多家醫(yī)院開展了40例原發(fā)性肝癌患者癌痛的臨床試驗，意外發(fā)現(xiàn)29例患者病情得到明顯緩解（總有效率＞70%），其中1例肝癌患者經(jīng)2個月治療后腫瘤縮小74%，腹水消失。袁愷［5］也發(fā)現(xiàn)蜂針可增強鎮(zhèn)痛藥對原發(fā)性肝癌患者癌痛的療效，而且在抑制病毒復制、保護肝細胞方面要好于單純鎮(zhèn)痛藥組。提示蜂毒對肝癌的治療有重要研究意義。但蜂毒的成分多，作用復雜，導致其臨床應用受到限制。因此提純蜂毒的主要成分蜂毒素，深入研究其藥理作用及機制，有重要應用價值。

蜂毒素（Melittin）是蜂毒的主要組成部分，約占蜂毒干重的50%［6］，是蜂毒中的主要有效成分之一，純化得到的蜂毒素是一個由26個氨基酸殘基組成的堿性多肽，分子式為C131H229N39O31，相對分子質(zhì)量為2 846.5。其分子結(jié)構(gòu)如圖1［7］所示。其N端和C端分別具有疏水和親水基團，具有典型的兩性分子結(jié)構(gòu)，具有很好的水溶性，能夠和細胞膜上的磷脂相互作用，是Ca2＋－ATP酶的抑制劑，促進鈣離子內(nèi)流［8］；可以抑制H＋，K＋－ATP酶、Na＋，K＋－ATP酶、GTP結(jié)合蛋白的內(nèi)在活性，導致細胞死亡。

圖1 蜂毒素的結(jié)構(gòu)

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，由于乙型肝炎病毒（HBV）感染和環(huán)境問題等，我國是全球肝癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，據(jù)統(tǒng)計，中國肝癌發(fā)病率居世界首［9，10］。肝癌患者的預后很差，在醫(yī)療發(fā)達的美國，1992年到2008年肝癌患者5年的生存率只有18%［11］。因此發(fā)現(xiàn)和研究治療肝癌的特效藥有重要意義。本篇旨在通過總結(jié)目前蜂毒素抑制肝癌的相關(guān)機制研究現(xiàn)狀，及各種蜂毒素的優(yōu)化制劑研究進展，從而探討其治療肝癌的臨床應用可能性。

1 蜂毒素抑制肝癌的機制

1.1 誘導肝癌細胞凋亡和細胞周期阻滯 腫瘤重要特性之一就是惡性增殖，其細胞增殖能力明顯高于正常細胞，因此其膜電位比正常細胞高，蜂毒素作為一種兩性溶解肽，對膜電位高的細胞有選擇性的殺傷作用，有研究證明蜂毒素可以選擇性抑制肺癌細胞活性而不損傷正常細胞［12］。其次，誘導腫瘤細胞凋亡也是腫瘤治療的一種有效方法。凋亡過程包括形態(tài)學變化、DNA斷裂、染色質(zhì)固縮、核膜破裂等，并且受細胞凋亡相關(guān)因子caspase－3、caspase－9、Fas、Bcl－2等的調(diào)節(jié)［13，14］。

有研究表明［15］10μg·mL－1蜂毒素即可顯著減少增殖細胞核抗原Ki67的表達，促進細胞凋亡，其增殖抑制率的IC50為6.68μg·mL－1，在體內(nèi)，3 mg·kg－1蜂毒素對SMMC－7721裸體鼠皮下腫瘤抑制率為48.2%。Li B等［16］用攜帶蜂毒素基因的重組腺病毒（AP－rAFP－Mel）侵染肝癌耐藥性細胞株BEL－7402，發(fā)現(xiàn)其同樣抑制細胞增殖并誘導其凋亡，并檢測到給藥后細胞表面凋亡相關(guān)的Fas配體明顯升高。張晨［17］應用純化的蜂毒素處理人肝癌細胞HepG2、Hep3B、BEL－7402和SMMC－7721，明顯抑制細胞增殖并干擾細胞周期的正常移行，表現(xiàn)為S期的阻滯；進一步研究顯示蜂毒素可誘導BEL－7402細胞凋亡相關(guān)蛋白Fas和線粒體APO2.7分子的表達，增強肝癌細胞磷脂酶A2的活性導致細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破。有研究［18］發(fā)現(xiàn)10μg·m L－1蜂毒素可促進HepG2細胞中caspase－9、caspase－3／PARP的活化及cytochrome c、smac／DIABLO的釋放。并且能夠引起鈣離子內(nèi)流從而活化CaMKⅡ－TAK1－MKK－JNK／p38信號通路，加入相應抑制劑能部分逆轉(zhuǎn)蜂毒素誘導的凋亡，表明此通路的活化與蜂毒素誘導的凋亡有關(guān)。

1.2 抑制轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成 Liu S等［19］利用HCC細胞系和MHCC97H及高轉(zhuǎn)Rac1的MHCC97H裸鼠原位肝癌模型研究得出：蜂毒素對高浸潤性的肝癌細胞MHCC97H體內(nèi)外都有抗轉(zhuǎn)移作用，介導癌細胞運動和細胞骨架聚合的蛋白Rac1在MHCC97H細胞中高表達，而蜂毒素明顯減少Rac1、ERK、JNK的表達，結(jié)果表明蜂毒素抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移與特異性抑制Rac1依賴的JNK通路有關(guān)。有學者［20，21］利用蜂毒素治療PMA誘導的Caki－1腎癌細胞，發(fā)現(xiàn)蜂毒素抑制活化蛋白AP－1和核因子NF－κB的活化，從而抑制MMP－9的表達和ERK、JNK的磷酸化。研究結(jié)果提示蜂毒素也可能通過調(diào)節(jié)此信號通路抑制肝癌的轉(zhuǎn)移。

Huh JE等［7］的研究表明，皮下注射0.5 mg·kg－1和5 mg·kg－1蜂毒素可以顯著抑制轉(zhuǎn)染了VEGF－A的高轉(zhuǎn)移肺癌，抑瘤率分別為25%和57%，抑制其血管形成數(shù)量；且體外實驗也證實蜂毒素可明顯抑制轉(zhuǎn)染了VEGF－A的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的增殖，同時正常HUVEC細胞的活性不受影響；而且前者細胞中VEGF受體－2（VEGFR－2）、COX－2、PGE－2表達減少，胞外信號調(diào)節(jié)激酶1／2和cjun－N末端激酶的磷酸化減少；相反的，p38絲裂原活化的蛋白激酶的磷酸化增加。因此，推測蜂毒素有抑制腫瘤血管生成的作用，而且此作用可能是通過抑制VEGFR－2和MAPK信號通路中炎性調(diào)節(jié)因子實現(xiàn)的。

1.3 蜂毒素的免疫調(diào)節(jié)作用 蜂毒是傳統(tǒng)治療風濕、類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物，因此在免疫系統(tǒng)中的作用不可忽視。王秋波等［22］通過對健康志愿者實施蜂毒蟄刺，而后檢測蟄刺前后血漿及PHA誘生PBMC中的IL－2，IL－4變化情況，發(fā)現(xiàn)蜂療后血漿及PBMC的IL－2明顯升高，IL－4降低，說明Th1細胞功能增強；IgG、IgA含量升高但無統(tǒng)計學意義。另外，Bellinghausen和Jutel等［23，24］的報道也發(fā)現(xiàn)蜂毒療法可促使機體出現(xiàn)Th2向Th1漂移的現(xiàn)象。Nam S等［25］研究發(fā)現(xiàn)蜂毒不依賴抗原提呈細胞（APCs）直接影響CD4＋T細胞的免疫活性，通過上調(diào)T－bet表達引起INF－γ增加，刺激Th2細胞向Th1細胞漂移。Schneider等［26］也發(fā)現(xiàn)蜂毒免疫大鼠5 d即出現(xiàn)輔助性T細胞與抑制性T細胞的比例由4.5∶1降低至1∶1，從淋巴結(jié)中獲得的淋巴細胞數(shù)明顯增加。高連臣［27］對15名風濕病者和5名健康人的T淋巴細胞亞群進行為期兩個月的分析，發(fā)現(xiàn)蜂毒治療后患者失調(diào)的T淋巴細胞亞群都趨于恢復正常。以上研究結(jié)果表明蜂毒與免疫系統(tǒng)有密切關(guān)系，其主要成分蜂毒素很可能在蜂毒的免疫調(diào)節(jié)中起主要作用。

朱萱萱等［28］研究發(fā)現(xiàn)蜂毒素0.32、0.63 mg·kg－1的劑量下能增加S180肉瘤鼠的T淋巴細胞酯酶陽性染色率，表明其具有增強T淋巴細胞功能的作用；而且蜂毒素0.32mg·kg－1能增強此小鼠的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（Reticuloendothelial System，RES）對碳粒廓清能力，增強RES單核巨噬細胞的吞噬功能，因此推測蜂毒素抗腫瘤機理可能與增強RES的吞噬功能和增強細胞免疫有關(guān)。Attia WY等［29］研究發(fā)現(xiàn)蜂毒素治療艾氏腹水癌（Ehrlich ascite tumor，EAT）小鼠可刺激巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞發(fā)揮功能，提示蜂毒素可能通過激活機體的細胞和體液免疫抑制腫瘤生長。靳弟等［30］利用小鼠肝癌H22細胞及其荷瘤小鼠研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒素在體內(nèi)外對H22肝癌都有明顯抑制作用，2、4 mg·（kg·d）－1的蜂毒素能夠增強T淋巴細胞功能和IL－2分泌。但蜂毒素在腫瘤尤其是肝癌的治療中具體的免疫調(diào)節(jié)途徑和作用，需要更進一步的研究。

2 蜂毒素的減毒增效制劑研究

雖然蜂毒素的抗腫瘤活性得到越來越多的研究和重視，但由于蜂毒素存在過敏反應，局部刺激作用明顯，溶血等副作用大［31，32］的問題，不利于臨床應用推廣。因此，研發(fā)具有減毒增效作用的藥物制劑或藥物載體具有重要臨床意義。

2.1 蜂毒素基因改造 蜂毒素多肽的不穩(wěn)定性和溶血副作用極大地限制了其臨床應用，針對此現(xiàn)象，Cao Y等［33］構(gòu)建了蜂毒肽雜合體，并在畢赤酵母中表達，表達產(chǎn)物有較強抗菌活性且不顯示溶血性。趙亞華等［34］對蜂毒素的分子結(jié)構(gòu)進行如下改造：將5位的纈氨酸（Val）變?yōu)榫彼幔ˋrg），第15位的丙氨酸（Ala）變?yōu)榫彼幔ˋrg），刪除16位的亮氨酸（Leu），而后將其連接酵母表達載體pPICZa－A獲得重組的表達質(zhì)粒pPICZa－A－MEL。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115后表達純化的蜂毒素，既保留了原有的抗菌活性又降低了其溶血性，對其抗腫瘤活性需進一步研究。陳江等［35］構(gòu)建MEL－EGFP融合蛋白，可有效避免蜂毒素被蛋白酶系統(tǒng)降解，并且結(jié)合至肝癌細胞HepG2表面，破壞細胞膜完整性。

大部分肝癌細胞分泌甲胎蛋白AFP而正常肝細胞不分泌AFP，因此利用AFP啟動子驅(qū)動治療基因的表達是目前肝癌靶向基因治療的重要手段［36］。李柏等［37］采用細胞內(nèi)高效同源重組法，構(gòu)建攜帶蜂毒素基因及甲胎蛋白（AFP）啟動子的重組腺病毒載體，利用重組的腺病毒轉(zhuǎn)染肝癌細胞，發(fā)現(xiàn)AFP陽性的HepG2、Hep3B和BEL－7402肝癌細胞株受抑制［38］，對AFP陰性的肝癌細胞株SMMC－7721及正常肝細胞無明顯影響，原因可能是蜂毒素在AFP陽性肝癌細胞中表達效率遠高于AFP陰性肝癌細胞及正常肝細胞，因此有特異性殺傷作用。

2.2 蜂毒素的脂質(zhì)體制劑 有研究表明與微粒相比，蜂毒素與脂質(zhì)體的曲面有很高的親和力［39］。胡海洋等［40］使用大豆磷脂、膽固醇、羧酸化PEG2膽固醇制備了蜂毒多肽空間穩(wěn)定脂質(zhì)體，并將二硫鍵穩(wěn)定抗人肝癌單鏈抗體聯(lián)結(jié)PEG2膽固醇末端。蜂毒多肽空間穩(wěn)定免疫脂質(zhì)體有較高的腫瘤細胞選擇性，對SMMC－7721細胞的殺傷能力遠強于蜂毒多肽空間脂質(zhì)體，而對Hela細胞的殺傷能力無明顯改變。這種選擇性殺傷可以增強蜂毒素治療肝癌的靶向性。有學者［41］用納米粒包裹蜂毒素，發(fā)現(xiàn)其比普通的脂質(zhì)體包封率高，顆粒均一穩(wěn)定，明顯減少紅細胞裂解，體內(nèi)抑制小鼠黑色素瘤的生長。而且給藥后在小鼠肝臟分布最多，其次是脾臟，因此推測其可能對肝癌有較好的療效。

泊洛沙姆188也是一種常用的藥物載體，可以降低血漿蛋白的調(diào)理和對藥物的吞噬，延長藥物在體內(nèi)駐留時間，實現(xiàn)減毒增效目的。有學者通過大鼠體內(nèi)的藥動學研究表明［42］經(jīng)泊洛沙姆188修飾后的蜂毒素脂質(zhì)體顯著延長了藥物在大鼠體內(nèi)的駐留時間，提高了藥物的生物利用度，且與膜修飾劑的用量有一定的正相關(guān)性。也有研究［43］通過用2%和5%的泊洛沙姆188修飾蜂毒素脂質(zhì)體發(fā)現(xiàn)，其粒徑會隨泊洛沙姆188比例增加而增大（前者約193.4 nm，后者約264.7 nm），但包封率都在90%以上。且相同劑量下對小鼠Heps肝癌的抑制作用大于蜂毒素單體，對血管損傷也大大減輕，因而顯示出其有減毒增效的優(yōu)勢。

3 結(jié)論與展望

蜂毒素作為蜜蜂毒的主要功能成分，近年來在其抗菌、治療關(guān)節(jié)炎等炎癥疾病的應用基礎上，其在腫瘤治療方面的作用和機制也受到越來越多的關(guān)注和研究。肝癌是我國的高發(fā)性高致死性疾病，因此研究蜂毒素治療肝癌的臨床前效果和可能的機制，可為研制肝癌新藥提供重要思路和臨床前研究基礎。

綜合目前蜂毒素對肝癌治療的基礎研究可以看出：蜂毒素治療肝癌的可能機制包括誘導肝癌細胞凋亡，抑制腫瘤MMP－9和NF－κB活化及下游通路ERK，JNK等激酶磷酸化從而減少肝癌轉(zhuǎn)移，通過抑制VEGF受體表達阻止腫瘤血管生成，但是否可以引起血管正?；韪钊氲匮芯?。蜂毒素對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)主要表現(xiàn)在增加Th1／Th2細胞比例，增強細胞免疫，但蜂毒素調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群的分子水平靶點以及對肝癌治療的意義需要進一步研究。蜂毒素減毒增效的制劑目前主要包括基因修飾，蜂毒素脂質(zhì)體制劑，蜂毒素納米粒制劑等，尤其是泊洛沙姆188修飾的蜂毒素脂質(zhì)體表現(xiàn)出減少溶血，提高生物利用度，增強抗肝癌效果等優(yōu)勢，對蜂毒素治療肝癌的臨床應用提供了實現(xiàn)的可能性。但目前對于泊洛沙姆188修飾的蜂毒素脂質(zhì)體對肝癌的轉(zhuǎn)移惡化、腫瘤血管生成的影響及分子機制，需要進行更深入的臨床前評價和研究。

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Research progress on mechanism ofmelittin in treatment of liver cancer and the optim ization ofmelittin preparations

LIU Shu-jun1，YANG Yong2，F(xiàn)U Ji-hua1
（1.College of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China；2.Drug Research Institute，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

Melittin，as amajor constituentand activity unitof Bee venom，is a basic polypeptide consisting of26 amino acid residues.It has extensive biological functions，such as antibacterial，anti－arthritis，analgesic，antiradiation etc.In recent years，the antitumor effects ofmelittin has attractedmore andmore attention and research.Researching the specificmedicine for the treatment of liver cancer could have important clinical implications.This article reviewed studies on themelittin in inducing of hepatocellular carcinoma cells apoptosis，inhibiting of angiogenesis and tumor cellmetastasis，regulating immune system and summarized the researches on the optimization ofmelittin which induced allergic reaction，hemolytic side effects ofmelittin.Therefore，this article aimed at exploring themechanism ofmelittin in the treatmentof liver cancer and its possible preparation type applied to clinical.

Melittin；Liver cancer；Mechanism；Toxicity reducing and efficacy enhancing

R285

：A

2095－5375（2014）03－0162－005

國家自然科學基金重大研究計劃（No.91129731）

劉淑君，女，研究方向：腫瘤藥理學，E－mail：mypersonal_89_earo＠126.com

傅繼華，男，博士研究生，副教授，研究方向：心血管藥理，Tel：025－86185226，E－mail：fjhn＠sohu.com