線粒體參與糖尿病腎病發(fā)生的研究新進(jìn)展

孫 悅(綜述)，甘 華(審校)

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎臟內(nèi)科，重慶 400016)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)為糖尿病累及微血管主要并發(fā)癥之一，是終末期腎病重要死亡原因。盡管采取多種臨床策略治療糖尿病及防范其并發(fā)癥，至少1/3患者腎功能仍逐漸降低至終末期。DN的進(jìn)展性、不可逆性、高發(fā)病及高致死率等特點(diǎn)備受研究者關(guān)注[1]，研究發(fā)現(xiàn)線粒體具備調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或凋亡、維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)能力。線粒體可通過加劇炎癥浸潤、血管纖維化促進(jìn)糖尿病腎損害：①高糖環(huán)境誘導(dǎo)線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)聚集，激活Toll樣炎癥信號通路；②解偶聯(lián)蛋白2、線粒體抗病毒信號分子失衡，誘導(dǎo)活性氧類等物質(zhì)表達(dá)；③線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(mitochondrial calcium uniporter，MCU)和線粒體鈣離子攝取蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1，MICU1)異常致線粒體Ca2+生理失穩(wěn)態(tài)。

1 DN與線粒體DNA

真核生物線粒體具有較獨(dú)立的母系遺傳體系。人的mtDNA基因組長16 569 bp，編碼37種蛋白，其中13種蛋白是呼吸鏈的主力軍。其DNA呈雙環(huán)結(jié)構(gòu)，具非甲基化CpG模體，類似原核質(zhì)粒[2]。故此機(jī)體免疫系統(tǒng)會“錯(cuò)認(rèn)”，mtDNA CpG結(jié)構(gòu)為外來致病因素，從而激發(fā)炎性介質(zhì)釋放。Barbalat等[3]和Sparwasser等[4]先后發(fā)現(xiàn)mtDNA可直接通過Toll樣受體9致炎。注射了氧化mtDNA的小鼠會患上關(guān)節(jié)炎，且檢測血中細(xì)胞比例情況，免疫細(xì)胞的升高以單核細(xì)胞為主[5]。腫瘤患者化療后，外周血mtDNA水平顯著增高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)mtDNA可直接激動Toll樣受體9，激活中性粒細(xì)胞趨化浸潤[6]。更為有力的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，心肌細(xì)胞胞液中mtDNA積聚，可誘發(fā)小鼠心力衰竭，剔除編碼溶酶體DnaseⅡ基因(編碼Dnase 2a，為溶酶體降解mtDNA的重要成分)或者注射Toll樣受體9的選擇性激活劑后，干預(yù)組小鼠死亡率顯著高于對照組；實(shí)驗(yàn)者解剖兩組小鼠心臟發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組小鼠左心室擴(kuò)張，鏡下觀察心肌細(xì)胞中CD68+巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞抗原6G細(xì)胞浸潤程度嚴(yán)重，且Ⅱ型膠原、白細(xì)胞介素6、干擾素α等纖維化及炎性因子表達(dá)水平顯著高于對照組[7]。上述資料顯示，線粒體不單純是供能細(xì)胞器，其還具有潛在致炎能力。另有報(bào)道，對DN小鼠的腎組織進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，發(fā)生腎損害小鼠腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的線粒體數(shù)量多于對照組[8]。Malik等[9]發(fā)現(xiàn),DN患者外周血細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)水平較正常組、糖尿病非腎病組顯著增高，提示線粒體在DN致病機(jī)制中扮演重要角色，這可能與病理狀態(tài)下線粒體受損裂變有關(guān)。正常生理活動下，各細(xì)胞有相對恒定的線粒體密度，受損的線粒體可通過自噬作用被清除。然而，當(dāng)機(jī)體遭受炎癥、缺血缺氧等打擊處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，活性氧類大量生成，線粒體受損開始發(fā)生分裂，造成細(xì)胞內(nèi)大量線粒體積聚。同時(shí)，由于mtDNA與活性氧類生成場所相近，導(dǎo)致其相互作用密切，mtDNA突變、裂解增加，通過Toll樣受體放大炎癥效應(yīng)[10]。

2 DN與線粒體調(diào)節(jié)通路

2.1解偶聯(lián)蛋白2 解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein-2，UCP-2)是一類線粒體內(nèi)膜載體，在人體多處組織表達(dá)，如脂肪、胰島及腎臟。其參與形成內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子漏，控制呼吸鏈質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制葡萄糖轉(zhuǎn)換腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，降低胰島素抵抗。除此之外，UCP-2作為氧化還原保護(hù)蛋白，通過降低活性氧類減輕氧化應(yīng)激損傷。UCP-2與生物體能量代謝密切相關(guān)，這一特點(diǎn)決定了其在代謝性疾病，尤其在糖尿病研究中的重要地位。

有文獻(xiàn)報(bào)道，UCP-2通過抗氧化作用改善高血糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，延緩糖尿病微血管病變的發(fā)生[11]。Qiu等[12]發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，糖基化終產(chǎn)物受體基因缺陷糖尿病小鼠的腎小球?yàn)V過率降低，蛋白尿增多，而UCP-2基因的表達(dá)上調(diào)，線粒體超氧化物歧化酶生成減少。另外，研究者發(fā)現(xiàn)UCP-2基因剔除DN小鼠模型的近曲小管細(xì)胞內(nèi)，線粒體ATP解偶聯(lián)作用被腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路替代，線粒體膜電位降低、超氧化物生成增多，加重了糖尿病腎臟損害，提示UCP-2通路在機(jī)體高糖狀態(tài)下可增加細(xì)胞應(yīng)激耐受力，代償器官功能[13]。然而，UCP-2高表達(dá)又可增加細(xì)胞耗氧量，使器官處于慢性相對低氧低能狀態(tài)，推動腎功能逐步轉(zhuǎn)入失代償狀態(tài)，屆時(shí)加重腎臟損害惡化[14-15]。UCP-2是一把雙刃劍，其在DN的中作用需更多的科學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。

2.2線粒體抗病毒信號分子 線粒體抗病毒信號分子又被稱為干擾素β啟動刺激因子1、人病毒誘導(dǎo)適配蛋白，是一種線粒體調(diào)節(jié)蛋白。識別受體視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I和黑色素瘤異化相關(guān)基因5與病毒特定RNA區(qū)域結(jié)合后，改變自身構(gòu)象，暴露C末端的胱冬肽酶募集結(jié)構(gòu)域段與線粒體抗病毒信號蛋白相連接，從而通過核因子κB激酶抑制劑/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子家族成員相關(guān)的核因子κB活化劑結(jié)合激酶1通路途徑，激活核因子κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3，誘導(dǎo)生成干擾素I及其他抗病毒分子[16-18]。此機(jī)制區(qū)別于核內(nèi)體Toll樣受體途徑，介導(dǎo)細(xì)胞液中抗病毒作用。

糖尿病是內(nèi)分泌紊亂相關(guān)的代謝性疾病，但有文獻(xiàn)報(bào)道，其與慢性炎癥狀態(tài)、免疫失衡有關(guān)。Stene等[19]發(fā)現(xiàn)，病毒感染與1型糖尿病發(fā)病的相關(guān)性，1型糖尿病患者血中病毒抗體水平與病情嚴(yán)重程度呈正比，而使用胰島細(xì)胞高親和性病毒(如柯薩奇病毒、腦心肌炎病毒)感染小鼠后，胰島β細(xì)胞因自傷免疫機(jī)制凋亡，血糖短期內(nèi)升高，達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，該實(shí)驗(yàn)成功模擬了1型糖尿病臨床及病理改變。另有流行病學(xué)調(diào)查表明，慢性病毒性肝炎患者罹患2型糖尿病的概率明顯增高[20]。上述信息提示，病毒感染可參與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。

既往文獻(xiàn)報(bào)道，病毒直接感染腎小球上皮細(xì)胞，并不會出現(xiàn)相應(yīng)臨床腎炎病理活檢樣改變。干擾素I雖然能有效抗病毒，但近幾年研究發(fā)現(xiàn)，病毒相關(guān)性免疫激活后大量釋放的干擾素I可誘發(fā)足細(xì)胞凋亡、系膜細(xì)胞增殖、蛋白尿增加、腎功能損害加劇，可作為腎損害獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而檢測糖尿病患者或糖尿病小鼠模型的外周血，均有線粒體抗病毒信號蛋白及干擾素I反應(yīng)性高表達(dá)[21-22]。該現(xiàn)象可能與糖尿病導(dǎo)致免疫力低下、病毒感染率增高有關(guān)，在反復(fù)感染過程中，加重腎臟損害。

3 MCU和MICU1

迄今為止，已有大量文獻(xiàn)證實(shí)線粒體功能紊亂可引起慢性微炎癥狀態(tài)、基質(zhì)降解及血管內(nèi)皮的纖維化，而發(fā)生機(jī)制均有Ca2+通道的異常調(diào)控的參與[23-24]。目前已將線粒體Ca2+通道的調(diào)節(jié)異常與多種疾病相互聯(lián)系，如心肌炎癥浸潤及心力衰竭越重，線粒體Ca2+水平越高；線粒體Ca2+水平與胰島β細(xì)胞分泌胰島素程度一致；給予線粒體Ca2+離子通路特異性阻斷劑后，細(xì)胞活性氧類生成水平下降，核因子κB、白細(xì)胞介素10等前炎性介質(zhì)的釋放也隨之下調(diào)[25]。線粒體Ca2+水平增高，是胞液Ca2+大量涌入引發(fā)的結(jié)果。而Ca2+細(xì)胞外液流動與調(diào)控活性氧類生成有關(guān)，目前考慮以下幾種機(jī)制：①Ca2+通過推動三羧酸循環(huán)，加快電子在傳遞鏈中的交換速度；②Ca2+可激活一氧化氮合酶活性，上調(diào)一氧化氮水平，抑制呼吸鏈中復(fù)合體Ⅳ活性，增加活性氧類含量；③Ca2+與心磷脂結(jié)合；④活性氧類大量積聚以及細(xì)胞鈣調(diào)節(jié)紊亂的出現(xiàn)，加劇細(xì)胞壞死，導(dǎo)致機(jī)體損傷與修復(fù)并行，加重DN血管病變。

DN病理改變主要為慢性進(jìn)展性微血管硬化，早期為腎小球毛細(xì)血管基膜增厚、系膜區(qū)基質(zhì)沉積，出現(xiàn)毛細(xì)管襻折疊及融合，阻塞毛細(xì)血管；而病情進(jìn)展到晚期，腎小球逐漸透明樣變并硬化形成，其特征性病理改變?yōu)榻Y(jié)節(jié)性腎小球硬化。有文獻(xiàn)表明，線粒體Ca2+水平增高與糖尿病所致蛋白尿、微血管纖維化程度呈正比關(guān)系，而予以鈣通道抑制劑后微量蛋白尿可基本消失，即提出早期使用藥物臨床干預(yù)可減輕甚至逆轉(zhuǎn)糖尿病腎損害[26]。

20世紀(jì)60年代，一種單向運(yùn)輸體在小鼠腎細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，并被確認(rèn)為線粒體攝取Ca2+主要環(huán)節(jié)，該過程并不需要ATP功能，不伴隨其他離子或分子共運(yùn)輸，與曾鑒定的亮氨酸拉鏈“EF”手形結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白1、線粒體鈉-鈣交換體特性不同[27]。Perocchi等[32]新發(fā)現(xiàn)的一種與線粒體攝取鈣有關(guān)的特殊蛋白，符合這種單向運(yùn)輸體特點(diǎn)，將其命名為MICU1，又名CBARA1(calcium binding atopy-related autoantigen 1)，為困擾科學(xué)界數(shù)十年關(guān)于線粒體鈣調(diào)控的問題提供了重要思路。前期序列分析發(fā)現(xiàn)MICU1的N端有單跨膜結(jié)構(gòu)域及兩個(gè)經(jīng)典”EF”手形結(jié)構(gòu),因此其被認(rèn)為參與線粒體Ca2+攝取及對細(xì)胞質(zhì)鈣離子升高緩沖過程，不影響線粒體呼吸過程及膜電位。后期研究提出，MICU1主要起著“看門人”的作用，通過感知線粒體基質(zhì)中的鈣濃度調(diào)節(jié)MCU活性，控制Ca2+攝取[28]。MCU是MICU1相對應(yīng)的線粒體鈣單運(yùn)輸體，同樣參與線粒體Ca2+攝入活動[29]。Chaudhuri等[30]應(yīng)用電壓鉗技術(shù)，精確測量HEK-293T細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子流動，發(fā)現(xiàn)MCU基因剔除或使用選擇性抑制劑釕紅，單向運(yùn)輸通道向線粒體內(nèi)泵入鈣離子的數(shù)目明顯減少。這兩種蛋白相輔相成，共同調(diào)控線粒體Ca2+流通。

Perocchi等[32]進(jìn)一步明確了MICU1及MCU功能對細(xì)胞造成的影響，發(fā)現(xiàn)MICU1可維持正常環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)線粒體的鈣攝取水平；一旦MICU1失活，線粒體會出現(xiàn)Ca2+超載，生成過量的活性氧類、阻斷ATP生成，并激活A(yù)MP激酶介導(dǎo)的自噬系統(tǒng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前已證實(shí)，這兩個(gè)分子之間平衡的破壞將會導(dǎo)致神經(jīng)元、心臟細(xì)胞、肝臟和其他器官受損[30-32]。雖然MCU、MICU1在DN中的研究尚未見報(bào)道，但其發(fā)生機(jī)制與糖尿病發(fā)生密切相關(guān)。這兩種蛋白被測定在體外腎細(xì)胞表達(dá)、且可影響腎細(xì)胞功能，其可通過影響線粒體Ca2+水平促進(jìn)糖尿病腎損害。

4 小 結(jié)

近年來線粒體結(jié)構(gòu)及功能紊亂在DN致病機(jī)制中所起的作用備受關(guān)注，對其機(jī)制的研究也取得了一定進(jìn)展。本文就相關(guān)資料中較新研究成果，如mtDNA致炎、線粒體蛋白通路異常、MCU和MICU1致鈣紊亂失衡等方面進(jìn)行綜述。由此可見，線粒體在DN發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。但以上各環(huán)節(jié)之間的相互聯(lián)系尚不夠緊密，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及探討。闡明這些機(jī)制及其聯(lián)系可能為早期阻斷由線粒體受損引發(fā)的炎癥過度釋放或蛋白異常表達(dá)、改善DN預(yù)后提供新的臨床治療思路。

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