表皮生長(zhǎng)因子的基礎(chǔ)研究及在耳鼻咽喉科中的臨床應(yīng)用

唐 強(qiáng)(綜述)，阮 標(biāo)(審校)

(1.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，重慶 401520； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，昆明 650031)

1962年，Cohen[1]【Cohen,1962 #1801】在純化小鼠頜下腺神經(jīng)生長(zhǎng)因子時(shí)發(fā)現(xiàn)一種可促進(jìn)新生小鼠開(kāi)瞼、長(zhǎng)牙的蛋白質(zhì),稱為牙-眼瞼因子,隨后將這一種活性成分加入培養(yǎng)的表皮時(shí)發(fā)現(xiàn)可直接促進(jìn)表皮的生長(zhǎng)，定名為表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)。1975年,Gregory[2]將其確認(rèn)為人表皮生長(zhǎng)因子。EGF是一類廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)、可促進(jìn)或抑制多類細(xì)胞生長(zhǎng)的多肽，由53個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為6×103左右。天然的EGF在人和動(dòng)物的體內(nèi)甚微，難以大量制備供應(yīng)于臨床，20世紀(jì)80年代以來(lái)，通過(guò)基因重組技術(shù)，人類已成功地生產(chǎn)出高純度且活性和天然產(chǎn)物高度一致的重組人表皮生長(zhǎng)因子(recombinant human epidernal growth factor,rhEGF)。目前，rhEGF已廣泛用于臨床。

1 EGF的生物學(xué)和生理學(xué)

1.1EGF的生物學(xué)

1.1.1EGF的分子結(jié)構(gòu)及其功能 EGF的分子結(jié)構(gòu)及其功能的研究是近年來(lái)發(fā)展較迅速的領(lǐng)域之一。在EGF的一級(jí)結(jié)構(gòu)研究方面，已通過(guò)氨基酸順序測(cè)定獲得了一系列關(guān)于人、小鼠、大鼠和豚鼠等來(lái)源的EGF有關(guān)資料。各類來(lái)源的EGF均具有一個(gè)同源核心序列，這一核心序列長(zhǎng)度為36～40個(gè)氨基酸殘基，其中包括6個(gè)組成3個(gè)二硫鍵的半胱氨酸殘基[3]。大鼠EGF(rEGF)的cDNA分析結(jié)果表明，EGF前體的C端含有一個(gè)Trp-Trp-Asn-Trp-Arg-His-(x)n序列，在Arg-His間經(jīng)胰蛋白酶內(nèi)切后即可產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量和C端順序類似人表皮生長(zhǎng)因子(human epidernal growth factor，hEGF)和小鼠EGF、含53個(gè)氨基酸殘基的多肽。正是由于核心序列和C端包含胰蛋白酶專一作用位點(diǎn)，使得各類來(lái)源EGF在一級(jí)結(jié)構(gòu)上具有高度的同源性。一系列的點(diǎn)突變、片段合成、化學(xué)修飾及兩個(gè)末端切除和共價(jià)連接研究結(jié)果表明，EGF的生物學(xué)活性主要由上述核心序列決定，第23位的異亮氨酸、第37位的酪氨酸及第47位的亮氨酸殘基對(duì)EGF的活性影響亦較大[4]。N端的第一個(gè)半胱氨酸殘基以前的序列缺損和共價(jià)連接及C端1～3氨基酸殘基的缺損均對(duì)EGF活性的影響不大。因此，在自然界存在多類分子大小不一但仍具有相似生物活性的EGF序列。

1.1.2EGF的理化特性 各類來(lái)源的EGF均為耐熱耐酸的多肽，其等電點(diǎn)為酸性，是最穩(wěn)定的蛋白質(zhì)之一。

1.1.3EGF受體及其與EGF的結(jié)合反應(yīng) EGF受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的研究亦是近年來(lái)較為活躍的領(lǐng)域之一。EGFR首先在20世紀(jì)80年代初期從人皮膚癌細(xì)胞株A-431中分離出，在該細(xì)胞株中EGFR過(guò)度表達(dá)20～50倍。EGFR為相對(duì)分子質(zhì)量170×103的膜嵌糖蛋白，含有EGF的高親和力專一結(jié)合位點(diǎn)，與受EGF激活的酪氨酸蛋白激酶在近細(xì)胞質(zhì)端緊密相連，并具有一個(gè)腺苷三磷酸結(jié)合位點(diǎn)。

EGF與EGFR結(jié)合后可誘導(dǎo)受體酪氨酸激酶活性，迅速增加磷酸脂酶C及酪蛋白激酶Ⅱ的活性改變，并可激活一系列重要基因[5]。在這些基因中，一類是可直接調(diào)控或誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因，另一類是調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的基因。前類受EGF激活的基因?qū)τ诩?xì)胞增殖的啟動(dòng)和調(diào)控具有重要意義，EGF可刺激此類基因迅速轉(zhuǎn)錄,這類基因包括：葡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，編碼“Zinc-finger”阻斷轉(zhuǎn)錄因子的Knox-24基因、核抗原Cyclin基因、編碼S100類阻斷鈣結(jié)合蛋白的Calcyclin基因、α-肌動(dòng)蛋白基因、編碼Ap-1(activator protein-1)類轉(zhuǎn)錄因子的c-Jun基因及c-Fos和c-myc基因。EGF對(duì)編碼轉(zhuǎn)錄因子的激活可刺激總的信使RNA的合成和激活上述第二類基因，但激活效果來(lái)得較慢，且這種激活與蛋白質(zhì)的合成有關(guān)。EGF刺激合成的蛋白質(zhì)包括：糖酵解酶、分泌金屬蛋白酶的運(yùn)載蛋白、血纖維蛋白溶酶激活因子、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、腺苷二磷酸/腺苷三磷酸載體蛋白及細(xì)胞附著因子等，這些蛋白在生長(zhǎng)的調(diào)控方面均起著重要作用[6-7]。因此，EGF與其受體的結(jié)合反應(yīng)可激活直接參與啟動(dòng)和調(diào)控細(xì)胞增殖的基因及編碼與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)有關(guān)的重要蛋白的基因。

1.2EGF的生理學(xué)功能 小鼠中存在EGF信使RNA的部位或組織有頜下腺、腎、肝、口腔、乳腺、胰腺、十二指腸、腦垂體、肺、脾、腦、淚腺等。靈敏的放射免疫分析技術(shù)現(xiàn)已探明，hEGF幾乎遍布人體所有體液，唾液和尿液中hEGF的平均含量分別為9.2×103ng/L和8×103ng/L，而血液中只有(0.2×103～1.5×103) ng/L，因此EGF不是循環(huán)激素。

由于EGF廣泛分布于體內(nèi)，而多類表皮細(xì)胞群對(duì)EGF的刺激能作出靈敏的反應(yīng)，且EGF為這些表皮的高度更新所必需。因此,在理論上EGF在活體內(nèi)亦參與同樣的生理反應(yīng)。外源性EGF給藥實(shí)驗(yàn)可產(chǎn)生廣泛的生理學(xué)反應(yīng)。對(duì)于胃腸道來(lái)說(shuō)，EGF主要起著保護(hù)細(xì)胞、促進(jìn)潰瘍愈合及抑制胃液分泌的作用。在口腔中，EGF可以刺激口腔黏膜的生長(zhǎng)和分化。EGF對(duì)角膜的損傷亦有促進(jìn)修復(fù)的作用。Kim等[8]報(bào)道濃度為5 g/L的EGF即可刺激兔角膜燒傷模型的上皮細(xì)胞的增殖而加快角膜創(chuàng)面的修復(fù)。

2 EGF與體表創(chuàng)面愈合

McCarthy等[9]應(yīng)用免疫組織化學(xué)法研究?jī)和療齻颊叩纳睥蚨葎?chuàng)面滲液發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)面再生皮島中及其邊緣，以及汗腺導(dǎo)管及附近均可見(jiàn)HB-EGF(heparin-binding EGF)。這種HB-EGF的非正常性分布表明EGF在創(chuàng)面修復(fù)中發(fā)揮作用，提示傷后創(chuàng)緣表面有反應(yīng)性的EGF沉積及再分布。因此，理論上完全可以通過(guò)EGF刺激細(xì)胞增殖、組織增生和重要胞間基質(zhì)的合成來(lái)促進(jìn)各類創(chuàng)面的愈合。Andree等[10]研究發(fā)現(xiàn)，被hEGF轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞被移植到大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面上較對(duì)照組在7 d內(nèi)擴(kuò)增了180倍，明顯加快創(chuàng)面的愈合時(shí)間。Cribbs等[11]外用EGF于深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面時(shí)發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面愈合時(shí)間較對(duì)照組顯著縮短。付小兵等[12]對(duì)人體慢性創(chuàng)面外用EGF進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，EGF治療8 d的創(chuàng)面表皮干細(xì)胞與短暫擴(kuò)充細(xì)胞不僅數(shù)量多，而且體積增大，治療14 d后的創(chuàng)面再生表皮的棘細(xì)胞層中有“干細(xì)胞島”出現(xiàn)，未經(jīng)EGF治療組治療8 d與14 d創(chuàng)面未見(jiàn)干細(xì)胞出現(xiàn)，結(jié)果提示，EGF促進(jìn)皮膚再生的主要機(jī)制之一可能與其誘導(dǎo)皮膚干細(xì)胞快速定向分化有關(guān)。EGF的促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用無(wú)論在動(dòng)物還是人體效果均是明顯的。

3 EGF在耳鼻咽喉科疾病中的臨床應(yīng)用

3.1EGF與鼓膜穿孔的愈合 O′Daniel等[13]用EGF治療貓急性創(chuàng)傷性鼓膜穿孔的愈合率為93%。Chauvin等[14]將EGF和透明質(zhì)酸用于治療豬慢性鼓膜穿孔，治愈率為100%。Mondain等[15]用免疫組織化學(xué)定位法發(fā)現(xiàn)豚鼠鼓膜創(chuàng)傷性穿孔后EGF表達(dá)，穿孔3 d表達(dá)達(dá)到高峰，5 d開(kāi)始下降，說(shuō)明EGF參與鼓膜修復(fù)調(diào)控。段文彬等[16]觀察EGF對(duì)豚鼠鼓膜穿孔的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組50例中2周內(nèi)77.8%鼓膜穿孔愈合，對(duì)照組50例中僅36.4%愈合，12周實(shí)驗(yàn)組治愈率為91.7%，對(duì)照組為75%，該實(shí)驗(yàn)觀察EGF組除上皮細(xì)胞增生外，纖維層血管也明顯增生，從而促進(jìn)鼓膜上皮增生，這是實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組愈合率高和愈合快的原因，通過(guò)掃描電鏡觀察EGF組，內(nèi)耳毛細(xì)胞無(wú)損傷，聽(tīng)性腦干反應(yīng)及眼球震顫電流描記檢查治療前后也無(wú)明顯改變，證明對(duì)內(nèi)耳功能無(wú)明顯不良反應(yīng)。熊觀霞等[17]亦發(fā)現(xiàn)rhEGF能促進(jìn)創(chuàng)傷鼓膜的組織修復(fù),且rhEGF局部應(yīng)用于創(chuàng)傷鼓膜后,在短期內(nèi)不會(huì)引起組織鈣化、瘢痕增生。龍海珊等[18]使用rhEGF明膠海綿貼補(bǔ)治療人外傷性鼓膜穿孔，依穿孔部位及形態(tài)分為前下、下半、后半和后下4組，發(fā)現(xiàn)治療組較對(duì)照組愈合時(shí)間(4周內(nèi))分別提前7.5、7.6、12.2、12.6 d未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)。崔萬(wàn)明等[19]在外傷性中等鼓膜穿孔和大穿孔中應(yīng)用rhEGF或rhEGF與貼膜聯(lián)合應(yīng)用,可以顯著地縮短愈合時(shí)間,并減輕鼓膜瘢痕,提高治愈率。林刃輿等[20]亦發(fā)現(xiàn)EGF有明顯促進(jìn)鼓膜穿孔愈合的能力，此外EGFR在鼓膜穿孔部位鄰近皮膚中等表達(dá),表明使用表皮生長(zhǎng)因子治療有誘發(fā)中耳膽脂瘤的風(fēng)險(xiǎn)。

3.2EGF與鼻竇炎

3.2.1EGF與慢性鼻竇炎 姜振東等[22]研究EGF在慢性鼻竇炎患者竇口鼻道復(fù)合體區(qū)域黏膜表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，EGF在鼻竇炎Ⅰ型與Ⅱ型病變竇黏膜中的假?gòu)?fù)層纖維柱狀細(xì)胞、增生的杯狀細(xì)胞以及黏膜下炎性細(xì)胞與正常對(duì)照相比較有較強(qiáng)的表達(dá)，Ⅰ型與Ⅱ型之間無(wú)明顯差異。EGF在慢性鼻竇炎病變黏膜的過(guò)度表達(dá)可能是慢性鼻竇炎病因與黏膜病理改變的重要原因。姜振東等[22]和丁國(guó)強(qiáng)[23]研究發(fā)現(xiàn)，EGF和EGFR在慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻竇黏膜中均有明顯表達(dá)，EGFR信號(hào)通路可能在慢性鼻竇炎的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

Hansson等[24]研究認(rèn)為，人鼻黏膜受到損傷后，再生的細(xì)胞胞質(zhì)中EGF水平明顯增加，這表明EGF參與了鼻竇黏膜創(chuàng)面修復(fù)。姜振東等[22]發(fā)現(xiàn)，EGF、EGFR在鼻竇內(nèi)鏡術(shù)后術(shù)腔的表達(dá)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，EGF、EGFR在術(shù)腔的表達(dá)，一方面可能促進(jìn)術(shù)腔創(chuàng)傷愈合，另一方面EGF、EGFR在術(shù)腔的過(guò)度表達(dá)可能與術(shù)腔囊泡、肉芽以及纖維結(jié)締組織的增生有密切的聯(lián)系。王鵬舉等[25]亦發(fā)現(xiàn)慢性鼻竇炎患者術(shù)后血液中的EGF開(kāi)始降低，術(shù)后4周左右降到最低水平，與術(shù)前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，6周后血液中的EGF水平逐漸升高，8周后接近正常水平，術(shù)后血液中EGF的變化模式與鼻內(nèi)鏡術(shù)后黏膜的轉(zhuǎn)歸以及創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程一致，進(jìn)一步說(shuō)明EGF在鼻內(nèi)鏡術(shù)后黏膜創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中具有重要作用。

王豐等[26]將rhEGF用于鼻內(nèi)鏡術(shù)后術(shù)腔換藥，發(fā)現(xiàn)用rhEGF側(cè)鼻腔黏膜水腫反應(yīng)較輕，上皮化快，完全上皮化時(shí)間為5～7周，患者疼痛癥狀輕，分泌物較少；而生理鹽水組則完全上皮化時(shí)間為6～8周，患者疼痛癥狀重，黏膜水腫較重，分泌物較多。說(shuō)明rhEGF能促進(jìn)術(shù)腔上皮化，縮短上皮化的時(shí)間。林潮楷等[27]對(duì)120例Ⅱ型鼻竇炎患者術(shù)后使用rhEGF噴灑術(shù)腔，臨床觀察發(fā)現(xiàn)，rhEGF能有效地促進(jìn)鼻竇炎術(shù)腔創(chuàng)面早日上皮化，縮短治愈時(shí)間。

3.2.2EGF與慢性萎縮性鼻炎 尤景敏等[28]將EGF應(yīng)用于萎縮性鼻炎的治療，觀察組治療后鼻腔黏膜紅潤(rùn)，痂皮消失，嗅覺(jué)改善，自覺(jué)頭痛、頭昏、鼻腔干痛癥狀消失，觀察組的有效率遠(yuǎn)高于對(duì)照組，觀察組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，應(yīng)用EGF治療萎縮性鼻炎較復(fù)方薄荷滴鼻劑方法效果有明顯的提高。

4 小 結(jié)

EGF發(fā)現(xiàn)和研究已有50余年歷史，生物學(xué)效應(yīng)及生理學(xué)功能決定了其廣泛的應(yīng)用。EGF是促生長(zhǎng)因子，它的缺乏或過(guò)度表達(dá)，均會(huì)破壞組織細(xì)胞增殖凋亡的動(dòng)態(tài)平衡，造成疾病的發(fā)生，目前已發(fā)現(xiàn)EGF在頭頸部腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，針對(duì)EGF的靶向治療可以成為今后頭頸腫瘤治療的新方向。由于EGF能促進(jìn)黏膜和上皮修復(fù)，能加快耳鼻咽喉手術(shù)后的術(shù)腔上皮化，隨著對(duì)EGF研究的深入，EGF必將在臨床應(yīng)用與生命科學(xué)研究中占據(jù)重要的地位。

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