急性白血病遺傳學改變的預后分析及微小殘留病檢測

劉以俊，周婧倩，王慧瑩，金盧陽，孫 婧(綜述)，何穎芝，李玉華※(審校)

(1.南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，廣州 510282； 2.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院血液科，廣州 510282)

隨著化療方案的改進和造血干細胞移植的進展，急性白血病(acute leukemia,AL)的完全緩解率得到明顯提高，然而仍有許多獲得完全緩解的患者在數(shù)年內復發(fā)。5年總體生存率僅為40%～50%[1]。白血病微小殘留病(minimal residual disease,MRD)是復發(fā)的主要原因。監(jiān)測MRD為預測復發(fā)的重要途徑。目前監(jiān)測MRD的方法主要有形態(tài)學、細胞遺傳學、熒光原位雜交、流式細胞技術和定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)。定量PCR目前應用較為廣泛。其靶基因有融合基因、突變基因和異常表達基因。隨著臨床實驗室檢測的進展，不斷有新的異常表達基因被發(fā)現(xiàn)，如表皮生長因子受體通路底物8(epidermal growth factor receptor pathway substrate 8，Eps8)，熱門的異常表達基因，如WT1(Wilms′s tumor-1 gene)又有許多新進展。該文所選取的WT1、尾型同源盒基因(caudal-type homeoboxgene,CDX)2和Eps8基因均可能有提示預后和監(jiān)測復發(fā)的作用。

1 WT1基因

1.1WT1基因的結構與功能 WT1基因是從腎胚胎腫瘤中分離得到的抑癌基因，位于染色體11p13上。WT1蛋白有4個鋅指結構，分別是Cys2-His2。同時，還含有富含脯氨酸(Pro)和谷氨酸酰胺(Gln)的區(qū)域，主要用于調節(jié)轉錄[2]。WT1基因主要表達于胚胎期，并且對泌尿系統(tǒng)的發(fā)育起重要作用。成年以后，WT1基因僅少量表達于腎臟、口腔、子宮內膜、睪丸、脾臟和正常造血干細胞[3]。

1.2WT1基因的臨床意義

1.2.1WT1基因的表達變化 WT1基因在骨髓細胞中極少量表達，在外周血細胞中幾乎不表達。大多數(shù)AL細胞中有WT1基因的高表達。但是，在WT1基因的表達與白血病診斷的亞型是否有關仍存在爭議。Schmid等[4]通過RT-PCR對125例急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)患者的骨髓標本進行了檢測，結果顯示，WT1基因在73%的患者中高表達。但是，診斷時的WT1基因高表達與患者的年齡、FAB(French-American-British)分型和染色體組形態(tài)等因素無關。Shimada等[5]對158例兒童AML患者進行了WT1 mRNA的定量分析顯示，初診的骨髓標本77.8%為WT1陽性，其中存在inv(16),t(15;17)和唐氏綜合征時WT1基因高表達，存在11q23染色體畸形時WT1基因低表達。

1.2.2WT1基因與AL的預后 盡管WT1基因在AL患者中高表達得到了專家的認可，但對其與AL預后的關系仍有爭議[4-5]。Polak等[6]用實時熒光定量PCR檢測了51例AML患者的外周血標本，結果顯示，異基因造血干細胞移植前WT1基因高表達的患者預后更差，且檢測外周血WT1含量有助于監(jiān)測MRD。Pozzi等[7]研究122例AML患者發(fā)現(xiàn)，67例(55%)患者有WT1基因的高表達，即高于100拷貝，并且WT1高表達較WT1低表達患者的復發(fā)率更高，5年生存率更低。Pozzi等[7]對17例WT1表達過高的患者進行了供者淋巴細胞輸注，這些患者的生存率為44%，而沒有接受該治療的21例WT1高表達患者的生存率僅為14%。據(jù)此，研究者認為WT1可用于提示AL患者的預后。Andersson等[8]發(fā)現(xiàn)，骨髓標本或外周血標本的WT1基因轉錄產(chǎn)物在1個月內降低一個數(shù)量級以上的患者，其復發(fā)率較低，生存率較高，因此研究者認為WT1基因有望成為成人AML的MRD監(jiān)測靶點。

也有專家質疑WT1基因對白血病預后的提示作用。Schmid等[4]通過RT-PCR的方法分析了125例AML的初診患者，結果顯示，WT1基因不能預測完全緩解率、緩解持續(xù)時間和生存率，認為其治療方案的不統(tǒng)一可能是導致陰性結果的原因之一。同時指出WT1基因對于MRD的預測作用還有待進一步研究。有報道稱，WT1基因在診斷時沒有提示預后的價值，但在化療結束后的M1亞型或有FLT3-ITD(FLT3-internal tandem duplication,FLT3-ITD)基因突變的AML中有此作用[5]。

對于WT1基因能否作為監(jiān)測MRD的靶點，人們一直存在爭論。有部分學者認同這一觀點[6,8-9]。Polák等[10]通過熒光定量PCR檢測了51例AML患者外周血的WT1基因，同時還用細胞形態(tài)學、流式細胞技術和檢測融合基因等方式監(jiān)測MRD，結果表明，檢測外周血WT1含量有助于監(jiān)測MRD，并且7例患者的WT1基因比其他監(jiān)測MRD的方法更加敏感。Polák 等[10]通過實時熒光定量PCR檢測151例AML患者后得出了相同的結論，同時還確定出AML緩解的WT1基因上限為0.02 WT1/ABL。據(jù)此上限，可以預測或早期診斷AML的復發(fā)。但是，也有研究結果與此相反[11-12]。Elmaagacli等[11]用PCR分析了46例AL的患者，認為WT1不能作為異基因造血干細胞移植后監(jiān)測MRD的靶點，MRD只能用于預測有t(15；17)異位的AML患者。Luna等[12]用高分辨溶解和熒光能量共振轉移雜交探針來檢測175例成年AML患者的WT1基因單核苷酸多態(tài)性rs16754，得出WT1同樣不能作為MRD靶點的結論。

2 CDX2基因

2.1CDX2基因、蛋白的結構與功能 編碼同源盒轉錄因子，可分為GSH(Glutathione Synthetase)2、CDX1、CDX2、CDX3和CDX4基因，有調節(jié)胚胎造血的功能[14]。CDX2基因位于人類染色體的13q12～12區(qū)，包含3個外顯子和2個內含子，CDX2蛋白對胚胎發(fā)育和成人腸上皮細胞的增殖和分化起著重要作用[15]。研究顯示，鼠骨髓祖細胞中CDX2的高表達會干擾淋巴細胞的生成[16]。同時，急性淋巴細胞白血病(acute lmphocytic leukemia,ALL)白血病細胞中CDX2的減少會抑制ALL前B細胞株Nalm-6集落的形成。

2.2CDX2基因的臨床意義

2.2.1CDX2基因與白血病發(fā)病 有t(12;13)(p13;q12)的AML同時表達了CDX2 基因和融合基因ETV6(ets variant 6)-CDX2。Rawat等[17]發(fā)現(xiàn)，只有當移植含有CDX2基因的白血病細胞后才能使小鼠患病。由此推測，異位表達的CDX2基因是導致AML的重要因素。有報道顯示，阻斷CDX2蛋白的N端可擾亂同源異型基因(homeotic genes,Hox)的表達，從而誘發(fā)白血病。針對151例AML患者的研究得出，環(huán)加氧酶的含量和Hox有相關性[18]。有報道顯示，CDX2基因在90%的AML患者中高表達，但在正常人的造血干細胞和祖細胞中低表達[15,18]。

2.2.2CDX2基因與白血病預后 Thoene等[16]發(fā)現(xiàn)，ALL中有CDX2的高表達，以ph(+)ALL、B-ALL和前T-ALL最明顯。CDX2水平與生存率呈負相關，并且CDX2的高表達可以作為ALL的一個危險因素。Lu等[18]用實時熒光定量PCR分析了108例AML患者和7名志愿者的CDX2基因表達情況，認為CDX2的高表達預示較低的完全緩解率。

Riedt等[19]用流式細胞技術和實時熒光定量PCR檢測了37例兒童ALL患者的CDX2轉錄產(chǎn)物，并將其與常規(guī)方法得出的MRD結果進行比較，發(fā)現(xiàn)CDX2/膽色素原脫氨酶>4%的患者更容易在開始化療33 d和完全緩解2周后出現(xiàn)MRD陽性。

3 Eps8基因

3.1Eps8基因、蛋白的結構與功能 Eps8基因全長169 436 bp，mRNA長為4088 bp，定位于人類染色體12p12.3。Eps8蛋白是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的底物之一，為一種相對分子質量為(68～97)×103的酪氨酸激酶。Eps8蛋白在細胞的運動、有絲分裂和骨架形成中起重要作用[19-20]。Eps8蛋白可分為三個區(qū)域，N末端的磷酸化酪氨酸結合區(qū)，中心的SH3(Src Homology 3 domain)區(qū)域，C末端的效應區(qū)域。SH3區(qū)域有連接的作用，有助于形成Eps8-Abil(E3bl)-Sos1復合物。C末端效應器可以激活Sos1(Ras和Rac蛋白的雙重鳥嘌呤核苷酸交換因子)[22]。

3.2Eps8基因的臨床意義

3.2.1Eps8基因在惡性腫瘤中的表達變化 在多個研究中，Eps8基因被證明在垂體瘤、子宮頸癌、口腔鱗狀細胞癌、結腸癌、胰腺癌和乳腺癌等實體瘤中高表達，而且Eps8多與癌細胞的增殖、入侵和轉移有關，有望成為白血病的治療靶點和監(jiān)測預后的指標[23-28]。最近研究顯示，血液學惡性腫瘤中也有Eps8基因的異常表達。熊文艷等[28]用實時熒光定量RT-PCR和Western-blot分析了KGla(人髓系白血病細胞株)、HL-60(人早幼粒細胞性白血病細胞株)、K562(人慢性髓系白血病、紅白血病變細胞株)、ARH-77(多發(fā)性骨髓瘤細胞株)、RPMI-8226(人多發(fā)性骨髓瘤細胞株)和Raji(人Burkitt′s淋巴瘤細胞株)的mRNA和蛋白質水平，結果顯示，上述細胞株中只有ARH-77有Eps8 mRNA的高表達，只有ARH-77和KG1a有Eps8蛋白的高表達。

3.2.2Eps8基因與白血病預后 在宮頸癌、甲狀腺癌和乳腺癌等實體瘤中，Eps8基因高表達預示腫瘤耐藥和預后不良[27-29]。在惡性血液腫瘤中，Eps8也有可能成為監(jiān)測預后的新靶點。Kang等[30]對97例兒童ALL患者的外周血和骨髓白細胞進行了基因表達譜的分析，統(tǒng)計分析顯示，除了年齡因素，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶3、易洛魁族同源盒2和轉化酸性卷曲含蛋白2對無事件生存率的影響較大，這三種基因與Eps8有關。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶3低表達的一組中預后良好，而余下的兒童按表達率不同的易洛魁族同源盒2和轉化酸性卷含蛋白2分成了兩組，兩組間的生存率有明顯差異，在此分類中，易洛魁族同源盒2、Eps8及三唑磷水解酶基因52表達提示兒童ALL預后不良。南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院血液科實驗室正在研究Eps8在白血病中的MRD監(jiān)測作用以及進行相關疫苗的研發(fā)。

4 小 結

目前，AL的完全緩解率已經(jīng)有較大提高，但復發(fā)仍是影響患者長期生存率的主要因素，因此監(jiān)測MRD有重大意義。隨著對WT1、CDX2和Eps8基因研究的不斷深入，它們對惡性血液腫瘤預后的提示作用逐漸得到學者的認可，同時也有越來越多的學者探尋其對MRD的監(jiān)測意義，但仍缺乏大樣本的隨機對照臨床研究。目前臨床采用的融合基因和突變基因的表達率和代表性都難以滿足需求。該文所述的基因有可能成為更加實時準確的MRD監(jiān)測靶點。

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