熱休克蛋白70對(duì)缺血性腦卒中的保護(hù)作用

劉 穎，章越凡，芮耀誠

(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海 200433)

腦卒中是一種常見的急性腦血管疾病，病死率和致殘率高。根據(jù)流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，我國每年新發(fā)腦卒中病人>200萬，每年死于腦卒中病人約150萬。腦卒中分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，缺血性腦卒中占全部腦卒中的60%～80%[1]。隨著人口老齡化不斷加快，缺血性腦卒中的發(fā)病率和病死率也在不斷增加[2,3]。

腦缺血后可觸發(fā)體內(nèi)損傷機(jī)制，如自由基的形成、炎癥反應(yīng)、興奮性細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡等，同時(shí)也可觸發(fā)保護(hù)性機(jī)制，如抗炎細(xì)胞因子、生長因子及內(nèi)源性抗氧化物的釋放。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)的形成及釋放是其中非常重要的保護(hù)機(jī)制。越來越多的研究表明，在缺血性腦卒中進(jìn)程中，腦組織中HSPs的表達(dá)水平直接關(guān)系到腦組織的損傷程度以及損傷的預(yù)后，因此熱休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp70)在缺血性腦卒中進(jìn)程中的保護(hù)作用也逐漸受到人們的關(guān)注。

1 HSPs家族概述

HSPs最早發(fā)現(xiàn)于1962年。Ritossa觀察到果蠅的唾液腺在高溫環(huán)境中會(huì)出現(xiàn)染色體蓬松現(xiàn)象，并且染色體具有轉(zhuǎn)錄活性，將這一具有轉(zhuǎn)錄活性的蛋白稱為HSPs，熱應(yīng)激、炎癥、缺氧、缺血、酸中毒等多種應(yīng)激均能誘導(dǎo)HSPs的產(chǎn)生。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小、抗原性的差異和產(chǎn)物的同源性，通常將哺乳動(dòng)物HSPs家族分為6類：Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40以及小相對(duì)分子質(zhì)量HSPs(15～30 ku)[4]。其中研究最多是Hsp70家族。人類Hsp70家族包括至少12名成員，其中最具代表性的為Hsp70、熱休克同源蛋白70(heat-shock cognate protein 70，Hsc70)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，Grp78)和Hsp75。Hsp70也稱Hsp72，在正常細(xì)胞中不表達(dá)或表達(dá)量較低，當(dāng)遇到熱應(yīng)激或接觸其他應(yīng)激源時(shí)表達(dá)量會(huì)迅速增加，故也稱為誘導(dǎo)型Hsp70。Hsc70是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在所有的細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)并且在熱應(yīng)激條件下沒有顯著變化[5]，屬于結(jié)構(gòu)型Hsp70。上述兩種HSPs具有相似的生物化學(xué)特性和高度的序列同源性。Grp78位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)；Grp75 (Hsp75)主要位于線粒體內(nèi)，這兩種蛋白質(zhì)具有類似的功能，在細(xì)胞內(nèi)主要以分子伴侶的形式發(fā)揮作用[6]。

2 缺血性腦卒中與Hsp70表達(dá)水平

研究表明在無應(yīng)激源刺激時(shí)，腦組織中的Hsp70 mRNA及Hsp70含量極低，當(dāng)出現(xiàn)局灶或全腦缺血時(shí)，受損細(xì)胞內(nèi)的變性蛋白會(huì)迅速誘導(dǎo)Hsp70表達(dá)。近年來，針對(duì)缺血性腦卒中后Hsp70在腦組織中表達(dá)情況的研究發(fā)現(xiàn)，隨著缺血時(shí)間的延長，Hsp70在腦組織不同區(qū)域以及不同時(shí)間的表達(dá)量存在差異，這種差異可能決定了神經(jīng)細(xì)胞能否繼續(xù)維持正常的生物功能。Chen等[7]報(bào)道大鼠在腦損傷后的30 min，神經(jīng)元Hsp70表達(dá)量開始增加，損傷后12 h達(dá)到峰值，損傷后1 d表達(dá)量開始減少。同時(shí)，腦缺血進(jìn)程中Hsp70的表達(dá)差異與腦組織的損傷程度相關(guān)，輕度缺血性損傷可誘導(dǎo)神經(jīng)元Hsp70 mRNA的轉(zhuǎn)錄和Hsp70翻譯；中度缺血性損傷只誘導(dǎo)Hsp70 mRNA轉(zhuǎn)錄，但不伴翻譯；較嚴(yán)重的缺血可抑制神經(jīng)元包括Hsp70在內(nèi)的幾乎所有蛋白質(zhì)合成，而膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞可表達(dá)Hsp70，提示Hsp70可以作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞或組織遭受可逆性缺血損害的生物學(xué)標(biāo)志[8]。

3 Hsp70在腦缺血中發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制

已有研究表明，Hsp70在腦缺血進(jìn)程中發(fā)揮著十分重要的保護(hù)作用。Ge等[9]研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理可以誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)Hsp70的表達(dá)，誘導(dǎo)生成的Hsp70可以與神經(jīng)細(xì)胞再次遭受致死性缺血損傷時(shí)產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)結(jié)合，減少這些具有細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)引起的細(xì)胞凋亡。Zhan等[10]在腦缺血模型大鼠尾靜脈注射重組Fv-Hsp70蛋白，可減少大鼠腦梗死體積并增強(qiáng)感覺運(yùn)動(dòng)功能，對(duì)缺血性腦卒中具有保護(hù)作用。目前認(rèn)為，Hsp70在缺血性腦卒中進(jìn)程中發(fā)揮保護(hù)作用可能主要通過以下幾種機(jī)制。

3.1 抗氧化應(yīng)激作用 機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下生成大量氧自由基，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，影響生物膜的通透性，對(duì)細(xì)胞及溶酶體、線粒體等亞細(xì)胞器造成破壞。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶是生物體產(chǎn)生氧自由基的關(guān)鍵酶，Hsp70可以通過抑制其活性從而減少氧自由基的產(chǎn)生，還可提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶的活性，加快氧自由基的清除[8]。Choi等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Hsp70可能在轉(zhuǎn)錄水平或通過轉(zhuǎn)錄后的修飾調(diào)節(jié)SOD-1的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。此外，Hsp70還可減少H2O2對(duì)細(xì)胞膜的損傷，減少細(xì)胞因活性氧引起的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡[8]。

3.2 抗炎及免疫增強(qiáng)作用 近來許多研究表明，炎癥在缺血性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展中起了重要作用[12]。在缺血導(dǎo)致的腦損傷中，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的起始步驟，隨后中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向缺血組織浸潤，導(dǎo)致血腦屏障功能障礙、腦組織水腫及神經(jīng)元死亡[13]。同時(shí)，損傷部位腦組織釋放的核苷酸、高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1, HMGB-1)和其他內(nèi)源性免疫刺激物，與小膠質(zhì)細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞結(jié)合并激活這些細(xì)胞，通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factorkappaB, NF-κB)、缺氧誘導(dǎo)因子-1 (hypoxia inducible factor-1, HIF-1)等促炎轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致多種免疫介質(zhì)的上調(diào)[14]，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。

Hsp70可通過作用于NF-κB途徑發(fā)揮抑制炎癥功能。NF-κB作為免疫炎癥反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子，通常與其抑制因子(I-κB)蛋白家族成員結(jié)合形成三聚體，并以這種無活性形式存在于胞漿中。當(dāng)機(jī)體遇到缺氧/缺血、組織損傷或感染等刺激時(shí)，I-κB被I-κB激酶 (I-κB kinase，IKK)磷酸化，隨后被泛素結(jié)合酶識(shí)別發(fā)生泛素化，繼而迅速被26s蛋白酶體降解。此時(shí)游離的NF-κB轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，特異性結(jié)合靶基因調(diào)控元件中的κB序列，以單獨(dú)作用或與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用的方式，在白介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase，iNOS)、環(huán)氧化酶-2 (cyclooxygenase-2，COX-2)等促炎介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄中起了關(guān)鍵性調(diào)控作用[15]。研究表明，由應(yīng)激引起Hsp70表達(dá)升高或Hsp70在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)會(huì)減少炎癥細(xì)胞中一氧化氮的產(chǎn)生以及一氧化氮合酶-2(NOS-2)的表達(dá)，同時(shí)可以減少星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB的活化[16]。在缺血性腦卒中模型中，Hsp70過表達(dá)可以減少NF-κB的激活以及向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位[17]，降低一系列免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

3.3 抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用

3.3.1 Hsp70可抑制線粒體凋亡通路的激活 線粒體凋亡通路被激活后，線粒體會(huì)向胞漿中釋放促凋亡因子，包括細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)、核酸內(nèi)切酶G等，Cyt C是其中重要因子之一。Cyt C進(jìn)入胞漿后與凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)以及三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)結(jié)合形成凋亡體(apopto-some)，同時(shí)激活caspase-9，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的caspase-3?；罨腸aspase-3進(jìn)一步激活脫氧核糖核酸酶，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

文獻(xiàn)報(bào)道Hsp70通過抑制線粒體釋放Cyt C，提高神經(jīng)細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧環(huán)境中的存活率[18]。Hsp70同樣能與AIF結(jié)合，并抑制AIF的核移位，從而減少缺氧/缺血性腦損傷后腦細(xì)胞的死亡[19]。此外，Hsp70可直接與Apaf-1結(jié)合，減少Cyt C介導(dǎo)的caspase通路的激活，同時(shí)抑制Apaf-1的聚集以及Apaf-1與caspase-9前體的結(jié)合[20]。在腦缺血再灌注損傷模型中，過表達(dá)Hsp70轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比，線粒體Cyt C釋放減少，Hsp70與Apaf-1結(jié)合增加，caspase-9的活化受到抑制，表明Hsp70對(duì)腦組織具有保護(hù)作用[21]。

3.3.2 Hsp70對(duì)Bcl-2家族的調(diào)節(jié)作用 Bcl-2和Bcl-xL是Bcl-2家族中主要的抗凋亡蛋白，具有維持線粒體外膜完整性的作用。相反，Bak和Bax等蛋白主要通過破壞線粒體膜的完整性促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。它們構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡。Hsp70可以作用于激活Bax蛋白活性的通路，抑制Bax構(gòu)象的改變使其無法進(jìn)入線粒體，阻礙線粒體中Cyt C和AIF等促凋亡因子向胞漿的釋放，抑制細(xì)胞凋亡[20]。研究發(fā)現(xiàn)，將Hsp70過表達(dá)之后，Bcl-2蛋白的表達(dá)升高并且穩(wěn)定性增強(qiáng)[22]。由此可見，通過增加Hsp70的表達(dá)可以在升高Bcl-2水平的同時(shí)降低Bax對(duì)線粒體膜的損傷，減少細(xì)胞凋亡。

3.3.3 Hsp70對(duì)其他凋亡相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié) 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一。其中，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是MAPK家族的重要成員。Kitamura等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過程中，JNK相關(guān)信號(hào)通路是重要途徑之一，Hsp70通過多靶點(diǎn)對(duì)這一途徑發(fā)揮抑制作用。在輕度熱休克中，Hsp70通過維持胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(excellular signal-regulating kinase 1/2, ERK 1/2)的穩(wěn)定，抑制應(yīng)激激酶p38和JNK1、JNK2的激活，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[24]。Bienemann等[25]也發(fā)現(xiàn)，Hsp70可以抑制JNK和c-JUN的活化，從而進(jìn)一步減少Cyt C的釋放以及caspase蛋白的激活，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

3.4 分子伴侶作用 分子伴侶是一類在序列上無相關(guān)性而功能上有相似性的蛋白質(zhì)，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)幫助新合成蛋白質(zhì)或未折疊蛋白質(zhì)完成正確折疊和組裝，但不構(gòu)成這些蛋白質(zhì)最終執(zhí)行功能時(shí)的組分。作為一種非特異性的細(xì)胞保護(hù)蛋白質(zhì)，Hsp70是目前發(fā)現(xiàn)并研究較多的主要分子伴侶蛋白質(zhì)之一。它以ATP依賴方式與未折疊多肽的疏水區(qū)結(jié)合以穩(wěn)定其未折疊狀態(tài)，促進(jìn)肽鏈的重新折疊或正確折疊。同時(shí)，Hsp70可以與仍結(jié)合在核糖體上的新生肽鏈結(jié)合，防止它們過早折疊，以幫助它們跨膜運(yùn)輸。更重要的是，當(dāng)細(xì)胞在應(yīng)激源刺激下產(chǎn)生大量未折疊、錯(cuò)折疊的蛋白質(zhì)時(shí)，Hsp70可幫助需要折疊的蛋白質(zhì)正確折疊，同時(shí)使聚集的蛋白質(zhì)解離，降低不溶性聚集物對(duì)細(xì)胞的損傷，維持細(xì)胞的正常生理功能[26]。在缺血性腦卒中進(jìn)程中，Hsp70可以修復(fù)受損細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)；并與細(xì)胞中因缺血損傷產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)結(jié)合，減輕這些細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損害，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦細(xì)胞的保護(hù)[27]。

4 結(jié) 語

Hsp70作為一種內(nèi)源性保護(hù)因子，在缺氧/缺血刺激下表達(dá)增強(qiáng)，可減輕腦缺血對(duì)神經(jīng)元的損傷，在缺血性腦卒中進(jìn)程中發(fā)揮保護(hù)作用。對(duì)Hsp70在腦缺血中保護(hù)作用機(jī)制的研究，有助于找到更加有效預(yù)防以及治療缺血性腦卒中的藥物，為缺血性腦卒中保護(hù)藥物的研發(fā)提供新的思路。

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