激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)原理及在腦血管疾病實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用＊

俞麗華 王 鍵 呂 磊 胡建鵬 陳業(yè)農(nóng)

安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽省合肥市 230038

腦血管疾病是各種病因使供應(yīng)腦部血液的血管發(fā)生病變所致的腦部病變，因其高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重危害人類的健康，我國第三次流行病學(xué)調(diào)查顯示該疾病已成為我國第一位死亡原因［1］。由于它危害性高，醫(yī)學(xué)界在研究其致病機(jī)理和尋找有效的防治藥物付出巨大努力。醫(yī)學(xué)界為研究腦血管疾病的致病機(jī)理和有效的治療手段付出巨大努力。隨著高科技的發(fā)展，激光掃描共聚焦顯微鏡（Laster scaning microscope，LSCM）技術(shù)出現(xiàn)為腦血管疾病病理病機(jī)探討和中藥如何發(fā)揮療效提供解決這些問題的良好契機(jī)。

1 LSCM 的基本原理［2～4］

1.1 LSCM的基本結(jié)構(gòu) 光學(xué)裝置、激光光源、掃描裝置、熒光顯微鏡、計(jì)算機(jī)處理和控制系統(tǒng)五部分組成。

1.2 光源更新和共聚焦技術(shù)應(yīng)用 普通光學(xué)顯微鏡用的是場(chǎng)光源，標(biāo)本每一點(diǎn)圖像都受到鄰近點(diǎn)衍射光或散射光的干擾。而激光共聚焦顯微鏡利用激光做光源，激光光源單色性很好，光源波長相同，這樣從源頭上消除了色差。物鏡的焦平面有一小孔的擋板，可將焦平面以外的雜光擋住。這樣又進(jìn)一步消除了色差。

1.3 點(diǎn)掃描與成像技術(shù)的應(yīng)用 將標(biāo)本分解成二維或三維空間上無數(shù)個(gè)點(diǎn)，用激光束逐層逐點(diǎn)掃描成像，便將斷層圖像和三維重建圖像有機(jī)結(jié)合，能提供細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的厚、長、寬、斷層面積和細(xì)胞體積等相關(guān)參數(shù)，給人以三維立體的概念然后通過計(jì)算機(jī)組成一個(gè)立體成像。最后用計(jì)算機(jī)進(jìn)行采集和處理經(jīng)光電倍增管放大的光信號(hào)。在載物臺(tái)上加一個(gè)微量步進(jìn)馬達(dá)，最小步進(jìn)距離為0.1μm，細(xì)胞和組織的各斷層圖像都可清晰顯示，具有細(xì)胞“CT”的功能。

2 在腦血管疾病實(shí)驗(yàn)研究中激光掃描共聚焦顯微鏡的運(yùn)用

2.1 形態(tài)學(xué)變化 LSCM用檢測(cè)孔與照明針共軛成像，對(duì)組織各層細(xì)胞分別成像，并對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行無損傷斷層掃描，有類似CT的功能，故有顯微“CT”的稱號(hào)。因此，LSCM在組織細(xì)胞內(nèi)部三維立體結(jié)構(gòu)的形態(tài)觀察有非常獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。趙敏［5］根據(jù)LSCM的成像原理及激光觀察大鼠腦缺血大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的變化，用lectin熒光標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察缺血中央?yún)^(qū)域、缺血半暗帶和正常組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的變化。發(fā)現(xiàn)在缺血中央?yún)^(qū)域可見大量壞死細(xì)胞，正常組織和假手術(shù)組中有細(xì)胞體積小，呈分支狀的小膠質(zhì)細(xì)胞，在缺血半暗帶則看見大量胞體增大，突起消失呈“阿米巴樣”的細(xì)胞，為激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞。韓冬［6，7］用LSCM技術(shù)研究觀察縫隙連接對(duì)大鼠腦缺血再灌注后血腦屏障通透性變化和缺血區(qū)不同部位縫隙連接分布情況，研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后縫隙連接在半暗帶區(qū)進(jìn)行再分布，縫隙連接斑比以前更大的，來加強(qiáng)細(xì)胞間信號(hào)傳遞及細(xì)胞間物質(zhì)交換。周琴［8］用大鼠腦局灶性缺血再灌注模型，用LSCM觀察缺血7d后腦微血管直徑和腦血管形態(tài)變化，研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸鈉能加快腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)，并可以減輕腦水腫，減小梗死體積，它的機(jī)制可能是促進(jìn)血管生成有關(guān)。阿魏酸為川芎、當(dāng)歸單體的有效成分，這一研究表明川芎、當(dāng)歸有治療腦血管疾病的作用。另外，莊明華等［9，10］運(yùn)用LSCM觀察活體家兔正常狀態(tài)下大腦皮質(zhì)內(nèi)循環(huán)及動(dòng)靜脈形態(tài)上的比較，結(jié)果觀察到血流速度、白細(xì)胞貼壁、血管口徑、吻合通路、紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等現(xiàn)象變化。

2.2 腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋測(cè)定 細(xì)胞內(nèi)Ca2＋作為膜穩(wěn)定劑、第二信使和代謝調(diào)節(jié)因子，它在機(jī)體的機(jī)能活動(dòng)中有著重要作用，它可介導(dǎo)多種病理細(xì)胞死亡。近來在腦缺血的研究中，神經(jīng)細(xì)胞Ca2＋超載是腦缺血損傷的重要機(jī)制，在腦缺血缺氧疾病演變過程中，Ca2＋在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)積聚是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的共同途徑。眾多學(xué)者已經(jīng)利用LSCM檢測(cè)Ca2＋濃度和分布情況。馬玉俠等［11］采用熒光雙標(biāo)技術(shù)并結(jié)合LSCM對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)活體腦片進(jìn)行觀察，用LSCM對(duì)腦片細(xì)胞內(nèi)Ca2＋熒光強(qiáng)度的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)采用側(cè)腦室定位注射L型鈣離子通道阻斷劑（Nitrendpine）及針刺腦缺血／再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2＋含量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室定位注射L型鈣離子通道阻斷劑對(duì)腦缺血／再灌注大鼠海馬有明顯抑制作用，針?biāo)幗M比模型組Ca2＋顯著降低，針刺組對(duì)Ca2＋升高的抑制作用優(yōu)于單純阻斷L型鈣離子通道阻斷劑的功能。該實(shí)驗(yàn)表明針刺治療可能阻斷L電壓門控型鈣離子通道，參與鈣穩(wěn)態(tài)，抑制鈣超載進(jìn)而拮抗腦缺血損傷。楊沙等［12］對(duì)熒光探針Fluo－3／AM 負(fù)載的活體腦片用LSCM進(jìn)行觀察，比較發(fā)現(xiàn)大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞Ca2＋不同時(shí)間點(diǎn)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞Ca2＋隨著缺血時(shí)間延長而升高，表明Ca2＋超載，提示腦缺血針刺治療越早越好。劉治軍［13］用LSCM研究發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷能抑制鼠類腦缺血再灌注所引起腦組織N－甲基－D天冬氨酸受體結(jié)合力和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度升高，減輕由鈣超載導(dǎo)致的腦組織損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用。徐海偉［14］用LSCM實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)褪黑素使疊氮鈉所導(dǎo)致的海馬錐細(xì)胞在超載狀態(tài)中，而且鈣離子濃度顯著下降，并存在一定的量效關(guān)系。李秀華等［15］用LSCM技術(shù)觀察大鼠短暫性腦缺血海馬細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度熒光像素值的變化，發(fā)現(xiàn)異丙酚與依托咪酯在處理大鼠短暫性腦缺血損傷保護(hù)作用與降低海馬細(xì)胞內(nèi) Ca2＋濃度關(guān)系密切。嚴(yán)燦等［16］運(yùn)用LSCM技術(shù)測(cè)量到在PC12細(xì)胞損傷模型中Ca2＋濃度，研究加味四逆散對(duì)谷氨酸和皮質(zhì)酮兩者所導(dǎo)致的損傷PC12細(xì)胞中游離Ca2＋濃度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組血清能顯著降低致?lián)p傷的PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度，從而降低鈣離子濃度，減輕Ca2＋超載對(duì)腦血管的損傷，發(fā)揮腦血管保護(hù)作用。

3 小結(jié)

激光掃描共聚焦顯微技術(shù)在腦血管疾病病理機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究和治療腦血管疾病中藥藥物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)揮重要作用，其應(yīng)用主要集中在細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞骨架、細(xì)胞間通訊、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度動(dòng)態(tài)測(cè)定，以及對(duì)腦部微循環(huán)和細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)觀察。目前國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)將它運(yùn)用到腦血管疾病的多種因素研究中去，如對(duì)活細(xì)胞中NO進(jìn)行實(shí)時(shí)、高靈敏的熒光探針、DNA在凋亡中變化、連續(xù)成像分析等等?？偠灾琇SCM由于它的三維立體成像技術(shù)和動(dòng)態(tài)測(cè)定、定時(shí)、定量等技術(shù)上具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，它將被越來越廣的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用，并且隨著LSCM技術(shù)的日益發(fā)展和完善，該項(xiàng)技術(shù)在腦血管疾病的機(jī)理研究和治療靶點(diǎn)研究方面將具有更大發(fā)展空間。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)在中藥方面研究還比較局限，目前在中藥研究方面主要集中在單體、有效部位及復(fù)方的研究，在中藥藥理及細(xì)胞藥物動(dòng)力學(xué)等方面運(yùn)用激光掃描共聚焦顯微有廣泛的前景。隨著愈來愈多中藥藥理和中醫(yī)針灸機(jī)理研究深入，腦血管疾病的治療也將會(huì)取得更大的發(fā)展空間。

［1］Zhu C.The Third National Survey on the cause of death.Ministry of Health，People’s Republic of China〔M〕.Beijing：Peking Union Medical University Press，2008：14－52.

［2］周疆明，程路明，賈宏濤.顯微鏡技術(shù)研究進(jìn)展〔J〕.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，43（S1）：53－56.

［3］李楠.激光掃描共聚焦顯微技術(shù)〔M〕.北京：人民軍醫(yī)出版社，1997：68.

［4］童應(yīng)鵬，張藝，張靜.激光掃描共聚焦顯微技術(shù)在中醫(yī)藥治療腦血管疾病研究中的應(yīng)用〔J〕.中藥藥理與臨床，2007，23（5）：257－259.

［5］趙敏，袁云，楊力，等.激光共聚焦觀察腦缺血大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的變化〔J〕.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，（10）：3－6.

［6］韓冬，馮加純，鄧方，等.縫隙連接對(duì)大鼠腦缺血再灌注后血腦屏障通透性的影響〔J〕.中華神經(jīng)科雜志，2007，40（7）：447－461.

［7］韓冬，薛晶，鄧方，等.應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡研究腦缺血再灌注后縫隙連接重分布〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2009，26（2）：163－165.

［8］周琴，廖維靖，楊萬同.阿魏酸鈉促進(jìn)局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)功能恢復(fù)和血管生成作用的研究〔J〕.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2006，21（3）：200－203.

［9］莊明華，白嘩，黃集前.共聚焦激光掃描顯微鏡活體觀測(cè)正常狀態(tài)下家兔大腦皮質(zhì)內(nèi)微循環(huán)〔J〕.微循環(huán)學(xué)雜志，2004，14（2）：24－26.

［10］莊明華，白嘩，黃集前.共聚焦激光掃描顯微鏡（MRC600）活體觀測(cè)家兔大腦皮質(zhì)內(nèi)微循環(huán)的動(dòng)物模型制作方法及其應(yīng)用探討〔J〕.微循環(huán)學(xué)雜志，2003，13（2）：45－47.

［11］馬玉俠，王舒，石學(xué)敏.電針對(duì)腦缺血／再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元L型鈣離子通道的調(diào)制作用〔J〕.山東中醫(yī)雜志，2007，26（6）：407－409.

［12］楊沙，沈燕，孫云浩，等.針刺對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞［Ca2＋］i的影響〔J〕.天津中醫(yī)藥，2012，29（2）：140－144.

［13］劉治軍，李林，葉翠飛.二苯乙烯苷對(duì)腦缺血嚙齒動(dòng)物腦NMDA受體及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2003，19（10）：1112－1115.

［14］徐海偉，黎海蒂，范曉棠.褪黑素在疊氮鈉所致的海馬錐體細(xì)胞鈣超載中的神經(jīng)保護(hù)作用〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（3）：201－204.

［15］李秀華，程曉燕，張巖.異丙酚與依托咪酯預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血損傷海馬區(qū)鈣離子的影響〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18（31）：3802－3804.

［16］嚴(yán)燦，宋清，吳麗麗，等.加味四逆散對(duì)皮質(zhì)酮、谷氨酸致?lián)p傷的PC12細(xì)胞內(nèi)游離Ca2＋濃度的影響〔J〕.中成藥，2009，31（10）：1501－1504.