20味中藥提取物對(duì)無乳鏈球菌的體外抑菌活性研究

彭練慈，殷中瓊，賈仁勇，2，李 莉，代如意，曲 徑，劉明輝，陳 萍

(1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安 625014;2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所，四川雅安 625014)

無乳鏈球菌Streptococcus agalactiae又稱B群鏈球菌(GBS)，可引起奶牛乳房炎，我國因無乳鏈球菌引起的奶牛乳房炎占總發(fā)病率的20% ～40%.目前，對(duì)于奶牛乳房炎的治療主要依賴抗生素，由于反復(fù)大量使用，造成乳汁中抗生素殘留日益嚴(yán)重，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，使乳房炎的治療效果不斷下降［1-2］.

中草藥具有調(diào)節(jié)畜禽機(jī)體免疫力、殺滅或抑制細(xì)菌和病毒等作用，并因其低毒、低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)越來越受到人們的重視［3］，從傳統(tǒng)中草藥中篩選出有效的抗無乳鏈球菌藥物符合食品安全和公共衛(wèi)生需要.本研究選取黃連Coptis chinensis等20味中藥作為研究對(duì)象，以水和乙醇對(duì)其有效成分進(jìn)行提取.通過測(cè)定黃連等20味中藥提取物對(duì)無乳鏈球菌的最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)和最低殺菌濃度(Minimal bactericidal concentration，MBC)，篩選得到具有良好體外抗菌活性的中藥提取物，然后通過棋盤稀釋法［4-5］研究不同中藥提取物兩兩聯(lián)合對(duì)無乳鏈球菌的體外抑制效果，為進(jìn)一步研制治療奶牛乳房炎的中藥組方制劑提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 無乳鏈球菌編號(hào)為CVCC1886，購自中國獸藥監(jiān)察所.1.1.2 藥材 黃連(產(chǎn)地四川，批次:080406)、黃芩Scutellaria baicalensis(產(chǎn)地陜西，批次:040824)、烏梅Prunusmume(產(chǎn)地四川，批次:120315)、虎杖Polygonum cuspidatum(產(chǎn)地四川，批次:081102)、地榆Sanguisorba officinalis(產(chǎn)地陜西，批次:040827)、蒲公英Taraxacum mongolicum(產(chǎn)地貴州，批次:100217)、苦參Sophora flavescens(產(chǎn)地云南，批次:081121)、何首

烏Po.multiflorum(產(chǎn)地甘肅，批次:080301)、茵陳Artemisia scoparia(產(chǎn)地河北，批次:080923)、秦皮Fraxinus rhynchophylla(產(chǎn)地山西，批次:100330)、金銀花Lonicera japonica(產(chǎn)地四川，批次:080919)、穿心蓮 Andrographis paniculata(產(chǎn)地四川，批次:100310)、黃柏 Phellodendron chinense(產(chǎn)地四川，批次:080923)、艾葉 Ar.argyi(產(chǎn)地甘肅，批次:080921)、魚腥草Houttuynia cordata(產(chǎn)地四川，批次:100310)、杜仲Eucommia ulmoides(產(chǎn)地云南，批次:080916)、連翹 Forsythia suspensa(產(chǎn)地四川，批次:100310)、白頭翁Pulsatilla chinensis(產(chǎn)地四川，批次:100310)、夏枯草 Prunella vu lg aris(產(chǎn)地河南，批次:101114)、紫花地丁Violae yedoensis(產(chǎn)地四川，批次:100310)20味中藥均購于四川雅安惠民堂藥業(yè)連鎖有限責(zé)任公司，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)藥學(xué)系副教授范巧佳鑒定為正品.

1.1.3 培養(yǎng)基 加有5%小牛血清的營養(yǎng)肉湯，鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按照常規(guī)方法制作，用于無乳鏈球菌的培養(yǎng).

1.1.4 儀器設(shè)備和試劑 電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、索氏提取器、微量進(jìn)樣器、二甲亞砜、無水乙醇、T型涂布棒、90 mm玻璃培養(yǎng)皿.

1.2 方法

1.2.1 有效成分的提取 按照文獻(xiàn)［6-16］的方法提取黃連等20味中藥的有效成分，烏梅、黃連、黃芩、虎杖、蒲公英、茵陳、秦皮、黃柏、魚腥草、紫花地丁、白頭翁、何首烏、苦參、穿心蓮、杜仲、連翹、金銀花和夏枯草采用乙醇回流提取法，地榆和艾葉采用超聲波提取法.各自合并濾液，濃縮制成浸膏，并計(jì)算浸膏得率.使用前將浸膏用適量二甲亞砜溶解，制成生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL的藥液，100℃流通蒸汽滅菌30 min，置于4℃冰箱備用.

1.2.2 細(xì)菌菌懸液的制備 挑取新鮮培養(yǎng)無乳鏈球菌的2個(gè)菌落接種于3 mL的肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)18～24 h后取出.吸取菌液0.5 mL，用生理鹽水作 10-1梯度稀釋，取 10-7、10-8、10-93個(gè)梯度的菌液0.1mL分別在6個(gè)鮮血瓊脂培養(yǎng)基上均勻攤開，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h.計(jì)算出原液的細(xì)菌個(gè)數(shù)為1.6×1011CFU/mL.

臨用前將菌原液用肉湯培養(yǎng)基稀釋成菌液濃度為1.6×109CFU/mL.

1.2.3 體外抑菌試驗(yàn) 測(cè)定MIC:采用試管2倍稀釋法，取18支滅菌試管，將其中16支分為試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，每組8支.18支試管分別加營養(yǎng)肉湯1 mL.在2組的第1管中分別加1 mL藥液，混勻后吸取1 mL至第2管中，依次類推，直至第8管，第8管吸取1 mL棄去.然后，向試驗(yàn)組的8支試管中加0.1 mL的稀釋菌液，陰性對(duì)照組8支試管不加菌液，加0.1 mL生理鹽水.第17管不加藥液加0.1 mL菌液作為陽性對(duì)照，第18管不加藥液和菌液作為空白對(duì)照.則試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的第1管至第8管的藥液濃 度 依 次 為 500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90 mg/mL.置于 37 ℃ 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)18～24 h.以無菌生長的最低稀釋度為MIC.

測(cè)定MBC:觀察藥物MIC以上未見細(xì)菌生長的各管培養(yǎng)物，分別各取0.1 mL移種至不含藥物的鮮血營養(yǎng)瓊脂平皿上，輕輕推開藥液，置37℃培養(yǎng)過夜，觀察有無細(xì)菌生長.平皿培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落者作為該藥的MBC［17］.

1.2.4 體外聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 根據(jù)單味中藥的體外抑菌結(jié)果，選擇其中抑菌活性較強(qiáng)的中藥分別以其中2種藥的 4MIC，2MIC，MIC，1/2MIC，1/4MIC 分別進(jìn)行聯(lián)合.以黃連與黃芩為例:用滅菌后的2 mL EP管50個(gè)，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組.在第1～6行沿X軸(從左到右)每管中依次加入用肉湯稀釋好的4MIC、2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC 的黃連藥液各 0.2 mL.以同樣的方法在第1～6列沿Y軸方向(從上到下)每管中依次加入用肉湯稀釋好的1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC、4MIC的黃芩藥液各0.2 mL，將兩藥混合均勻后加入制備好的菌液40μL，對(duì)照組加入等量的營養(yǎng)肉湯，其他操作同試驗(yàn)組.37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果.

結(jié)果判斷依據(jù):聯(lián)合抑菌指數(shù)(Fraction inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)=甲藥聯(lián)合時(shí)的MIC/甲藥單獨(dú)時(shí)的MIC+乙藥聯(lián)合時(shí)的MIC/乙藥單獨(dú)時(shí)的MIC.FICI≤0.5時(shí)為協(xié)同作用，0.5＜FICI≤1時(shí)為相加作用，1＜FICI≤2時(shí)為無關(guān)作用，F(xiàn)ICI＞2時(shí)為拮抗作用.

2 結(jié)果與分析

2.1 20味中藥提取物對(duì)無乳鏈球菌的體外抑菌活性

20味中藥提取物對(duì)無乳鏈球菌的體外抑菌結(jié)果見表1.由表1可知，黃連、黃芩、烏梅、虎杖和地榆5味中藥提取物的MIC的范圍為7.80～31.25 mg/mL，MBC≤31.25 mg/mL抑菌效果最好.蒲公英、茵陳、秦皮、艾葉和紫花地丁5味中藥提取物的MIC均為62.50 mg/mL，抑菌效果較好.黃柏等10味中藥提取物的MIC均大于或等于125.00 mg/mL，抑菌效果較差.

表1 20種中藥提取物對(duì)無乳鏈球菌的體外抑菌活性Tab.1 Antim icrobial activities of active ingredients extracts of twenty tradition Chinese medicines to Streptococcus agalactiae in vitro mg·mL-1

2.2 黃連等4味中藥提取物對(duì)無乳鏈球菌的體外聯(lián)合抑菌活性

通過單味藥的體外抑菌結(jié)果，選擇黃連、黃芩、虎杖和地榆進(jìn)行體外聯(lián)合抑菌試驗(yàn)，聯(lián)合抑菌結(jié)果見表2.根據(jù)FICI值的判定依據(jù)，黃芩提取物與虎杖提取物、黃芩提取物與黃連提取物及黃連提取物與虎杖提取物對(duì)無乳鏈球菌的FICI≤0.50，為協(xié)同作用.地榆提取物與虎杖提取物及地榆提取物與黃芩提取物對(duì)無乳鏈球菌的FICI＞2，為拮抗作用.地榆提取物與黃連提取物對(duì)無乳鏈球菌的FICI=1，為相加作用(表2).

表2 4味中藥兩兩聯(lián)合用藥對(duì)無乳鏈球菌的FICI1)Tab.2 The FICI to pairw ise combination of four herbs against Streptococcus agalactiae

3 討論

中藥成分復(fù)雜，提取其中的有效成分對(duì)于提高其藥效具有重要作用.中藥提取方法眾多，其中乙醇回流法、超聲波提取法因操作簡單方便，適合試驗(yàn)操作而被廣泛使用.

本研究根據(jù)20味中藥的不同有效成分，分別采用乙醇回流法和超聲波提取法對(duì)20味中藥的有效成分進(jìn)行提取［6-16］，沿用文獻(xiàn)報(bào)道篩選的最佳工藝條件，使有效成分得到了極大的提取，從而保證了藥效.

20味中藥提取物的體外抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，虎杖、黃連和黃芩的 MIC分別為15.60、31.25、7.80 mg/mL，其MBC≤31.25 mg/mL說明黃連、黃芩和虎杖具有很強(qiáng)的抑菌作用.該結(jié)果與王慶玲等［17］和金建玲等［18］報(bào)道結(jié)果一致.抑菌活性好的地榆及抑菌活性較好的紫花地丁和蒲公英比金建玲等［18］報(bào)道的抑菌效果更優(yōu).本研究選取文獻(xiàn)報(bào)道中篩選出的最佳提取工藝條件對(duì)黃連［6］、黃芩［7］、虎杖［8］等20味中藥的有效成分進(jìn)行提取，使提取物中的有效成分盡可能地多，從而達(dá)到了較好的抑菌效果.陳微等［19］報(bào)道夏枯草和黃柏對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌有很好的抑菌活性，但在本研究中對(duì)無乳鏈球菌的抑菌效果并不好，可能因?yàn)椴煌奶崛》椒ㄒ约爸兴幪崛∥锏膒H不同，對(duì)不同的細(xì)菌產(chǎn)生不同的抑菌效果，且提取物中不溶成分偏多，對(duì)中草藥抗菌活性成分有一定的影響，使得抑菌效果不那么理想.

聯(lián)合抑菌試驗(yàn)顯示，黃連和黃芩、虎杖聯(lián)合都產(chǎn)生協(xié)同作用，具有良好的抗菌作用.地榆和黃芩、虎杖聯(lián)合都產(chǎn)生拮抗作用.地榆的有效成分是鞣質(zhì)，具有大分子多元酚類結(jié)構(gòu)，容易發(fā)生縮合反應(yīng)或沉淀反應(yīng)而失去相應(yīng)的抗菌活性，與黃芩、虎杖聯(lián)合后，3種有效成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，可能使藥物的有效結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致聯(lián)合后產(chǎn)生拮抗作用.

本研究表明，黃連、黃芩和虎杖聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)了抑菌效果，可以組成一個(gè)復(fù)方.本研究為抗無乳鏈球菌的中藥組方提供參考.

［1］倪春霞，蒲萬霞，胡永浩，等.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及耐藥性分析［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19(2):20-24.

［2］楊銳，李英倫，李金良，等.四川雅安臨床型奶牛乳房炎病原菌分離鑒定及耐藥性分析［J］.中國獸醫(yī)雜志，2009，45(4):41-42.

［3］閆麗霞.中藥制劑技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

［4］MARCHETTIO，MOREILLON P，GLAUSER M，et al.Potent synergism of combination of the combination of fluconazole and cyclosporine in Candida albicans［J］.Antimicrob Agents Chemother，2000，44(9):2373-2381.

［5］MUKHERJEE P K，SHEEHAN D J，HITCHCOOK C A ，et al.Combination treatment of invasive fungal infections［J］.Clin Microbiol Rev ，2005，18(1):163-194.

［6］王志華，陳碧.黃連提取方法的試驗(yàn)研究［J］.實(shí)用藥物與臨床，2008，11(3):191-192.

［7］石俊英，張小偉，張會(huì)敏.正交試驗(yàn)法優(yōu)選黃芩苷提取純化工藝［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，32(5):413-415.

［8］劉丹，湯海峰，張三奇，等.虎杖中有效成分提取方法的研究［J］.中成藥，2007，29(4):516-521.

［9］劉夢(mèng)茵，劉芳，周濤，等.烏梅乙醇提取物抑菌作用及其抑菌成分分析［J］.食品科學(xué)，2011，32(17):190-192.

［10］唐志國.優(yōu)選地榆鞣質(zhì)的超聲波提取工藝［J］.中國民康醫(yī)學(xué)，2011，23(6):764-765.

［11］于玲，劉影，閻婷，等.秦皮中秦皮乙素的提取純化工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(22):11236-11237.

［12］范家佑，張松竹.黃柏中總生物堿的提取工藝優(yōu)化［J］.井岡山學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31(5):112-117.

［13］馮麗娟，孫智勇，陳芳，等.三種方法提取的艾葉有效成分的抑菌作用比較［J］.食品工程，2011，56(4):35-37.

［14］黃亮，王金龍，李方，等.魚腥草葉乙醇提取液的抑菌作用研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(2):719-722.

［15］宋科標(biāo)，時(shí)維靜，周杰，等.白頭翁提取方法比較［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2011，13(4):19-21.

［16］陳胡蘭，湯沛然，陳興，等.紫花地丁抗炎及體外抑菌作用活性部位的篩選研究［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31(2):52-53.

［17］王慶玲，李保院，邱世翠，等.虎杖的體外抑菌作用研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17(5):762-763.

［18］金建玲，王劍，高培基.30余種常見中藥對(duì)肺炎鏈球菌的體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)研究［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2009，28(3):56-58.

［19］陳微，曾艷，賀月林，等.20種中草藥體外抑菌活性研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2010，12(3):34-36.

【責(zé)任編輯 柴 焰】