高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛(羊)奶中阿莫西林的殘留

李帥鵬，黃顯會(huì)，許 穎，郭春娜，孔祥凱

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642)

阿莫西林(Amoxicillin)又名羥氨芐青霉素，是一種最常用的青霉素類廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素，具有殺菌能力強(qiáng)，口服吸收好，血藥濃度高，且不受食物影響的特點(diǎn)［1］，醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床應(yīng)用廣泛.阿莫西林對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌、炭疽桿菌、胸膜肺炎放線桿菌等幾種常見(jiàn)的致病菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，廣泛應(yīng)用于治療各種動(dòng)物泌尿道、呼吸道和皮膚的敏感菌感染［2］.國(guó)外已批準(zhǔn)用于治療牛、犬和貓的疾病，國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)使用阿莫西林治療牛、豬和家禽的敏感菌感染.其作用機(jī)理是與細(xì)菌胞質(zhì)膜上的青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)結(jié)合，使其失去活性，導(dǎo)致細(xì)胞壁合成受阻，最終使細(xì)菌裂解而死亡［3］.

奶中阿莫西林的殘留，會(huì)引起敏感人群的過(guò)敏反應(yīng)和細(xì)菌耐藥性的增加，導(dǎo)致奶制品質(zhì)量和產(chǎn)量下降，給乳品加工業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失.阿莫西林殘留是當(dāng)前歐盟和北美等國(guó)家對(duì)進(jìn)口動(dòng)物食品的必檢項(xiàng)目之一［4］.為確保消費(fèi)者健康，避免消費(fèi)者受到阿莫西林殘留的危害，許多國(guó)家規(guī)定了阿莫西林的最高殘留限量(Maximum residue limit，MRL).歐盟規(guī)定牛奶中阿莫西林的最高殘留限量為4μg·L-1［5］，農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告規(guī)定食品動(dòng)物中靶組織的最高殘留限量分別是50(肌肉、脂肪、肝臟、腎臟)和10(奶)μg·kg-1［6］.

奶、蜂蜜和組織中阿莫西林的檢測(cè)方法目前報(bào)道的有微生物檢測(cè)法［7-8］、酶聯(lián)免疫分析法［9］、高效液相色譜與熒光檢測(cè)器［1］、紫外檢測(cè)器［2，4，10-11］和質(zhì)譜檢測(cè)器［12-21］聯(lián)用.高效液相色譜法的靈敏度低，樣品處理通過(guò)衍生化和SPE柱凈化來(lái)實(shí)現(xiàn)，操作繁瑣;高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法多為β-內(nèi)酰胺類抗生素多殘留檢測(cè)，對(duì)奶中阿莫西林殘留檢測(cè)的專屬性不強(qiáng)，且均需要SPE柱凈化，成本較高.本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)分析奶中阿莫西林殘留，通過(guò)乙醇提取，正己烷凈化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的處理，該方法操作簡(jiǎn)單快速，避免了衍生化和SPE柱凈化的繁瑣步驟，成本較低，靈敏度高，精密度和重復(fù)性好.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

API 4000電噴霧-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配 Analyst4.1.5軟件(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);Agilent 1200型液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司);Milli-Q純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司);Mach1.6 R冷凍型離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);Luna 5μm C18色譜柱(美國(guó)Phenomenex公司).阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 86.4%，批號(hào)K0221206，為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品;甲酸和乙腈為色譜純(德國(guó)CNW公司);乙醇、正己烷、乙酸銨均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 溶液的配制

500 mg·L-1阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱取5.79 mg阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇乙腈溶液溶解并定容至刻度，配成500 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱中避光保存.臨用前用pH 4.5的乙酸銨溶液稀釋成阿莫西林系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液.10 mmol·L-1乙酸銨溶液:精密稱取乙酸銨0.154 g，用純水溶解并定容至200 mL，冰醋酸調(diào)pH至4.5.

1.3 樣品前處理方法

稱取2 g空白奶樣品于15 mL EP管中，加入8 mL乙醇，旋渦混勻1 min，以10 000 r·min-1(溫度低于4℃)離心15 min;轉(zhuǎn)移上清液至梨形瓶中，37℃條件旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約0.5 mL，取下梨形瓶，立即加入乙酸銨溶液1 mL，旋渦混勻1 min，轉(zhuǎn)移溶液至另一15 mL EP管中，用乙酸銨溶液定容至2 mL;取1 mL上述溶液于2 mL EP管中，加入正己烷0.8 mL除脂，渦旋混勻，以10 000 r·min-1(溫度低于4℃)離心10 min，棄去上層正己烷，下層水相過(guò)0.22μm水相濾膜，供HPLC-MS/MS檢測(cè).

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取2 g空白奶樣品于15 mL EP管中，按“1.3”方法處理樣品，用所得空白基質(zhì)液將阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成 1、2、5、10、50、100、400 μg·L-1，用HPLC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè).每一水平設(shè)5個(gè)平行樣品同日檢測(cè)，連續(xù)測(cè)定5日.以測(cè)得阿莫西林峰面積平均值為縱坐標(biāo)(y)，質(zhì)量濃度(μg·L-1)為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得其回歸方程和標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.5 方法的靈敏度

精密稱取空白奶樣品2 g，依次加入不同質(zhì)量濃度的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液100μL，渦旋混勻，使得樣品中阿莫西林的添加質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·L-1，按“1.3”方法處理樣品.以信噪比S/N≥3確定檢出限(LOD)，以信噪比S/N≥10確定定量下限(LOQ).

1.6 回收率和精密度的測(cè)定

回收率和精密度的計(jì)算，采用在空白奶樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行檢測(cè).根據(jù)農(nóng)業(yè)部對(duì)阿莫西林制定的 MRL及殘留控制要求，在 LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL 4 個(gè)添加水平，2 g空白奶樣品中分別添加 40、100、200、400 μg·L-1的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)工作液100μL，即奶中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2、5、10、20 μg·kg-1，旋渦混勻，按“1.3”方法處理樣品，每一水平設(shè)5個(gè)平行樣品同日檢測(cè)，連續(xù)測(cè)定5日.求得空白奶中添加阿莫西林回收率的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，同時(shí)計(jì)算日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.

1.7 抽樣檢測(cè)

從市場(chǎng)購(gòu)買新鮮牛奶和羊奶100 mL，牛奶和羊奶樣品各取15份，共抽檢30份樣品，每份樣品2個(gè)重復(fù)，按“1.3”方法進(jìn)行制樣和檢測(cè).

1.8 色譜－質(zhì)譜條件

1.8.1 色譜分離條件 Luna 5μm C18色譜柱(150 mm×2.1mm，5μm;美國(guó) Phenomenex公司);流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序:0～1 min，0～40%A;1～3.5 min，40%A;3.5～4 min，40% ～0 A;4 ～10 min，0 A;流速:0.25 mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:5μL.

1.8.2 質(zhì)譜條件 ESI正離子模式掃描(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)采集方式;離子源溫度700℃，電噴霧電壓4 kV，霧化氣壓力55 kPa，輔助氣壓力35 kPa，氣簾氣壓力15 kPa.阿莫西林的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù):母離子m/z為366.3，子離子 m/z為349.2、208.2，其中m/z366.3/349.2為定量離子對(duì);碰撞能量(CE)13 eV/19 eV;去簇電壓(DP)58/45 V;碰撞室射出電壓(CXP)10 V;射入電壓(EP)10 V.

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的確定

阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg·L-1)分別在正離子和負(fù)離子模式下全掃描，發(fā)現(xiàn)阿莫西林在正離子模式下的響應(yīng)值更高.阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg·L-1)在正離子模式下全掃描，得到［M+H］+(m/z 366.3)準(zhǔn)分子離子峰.對(duì)m/z 366.3進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜全掃描，得到阿莫西林二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖.阿莫西林的質(zhì)譜行為較簡(jiǎn)單，主要為分子脫NH3生成的［MNH3+H］+(m/z 349.2)和β-內(nèi)酰胺斷裂生成的m/z208.2、113.9和160.0.在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式下，改變碰撞能量，其中m/z 349.2和208.2的強(qiáng)度相對(duì)較大，干擾較小，選擇m/z 208.2為輔助定性離子，m/z349.2為定量離子.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

按“1.4”方法進(jìn)行操作，得牛奶中阿莫西林的回歸方程y=3 868.9x+546.4，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8;羊奶中阿莫西林的回歸方程y=4 041.8x+1 254.0，相關(guān)系數(shù)r=0.999 4.

2.3 方法的靈敏度

以信噪比S/N≥3確定檢出限(LOD)，以信噪比S/N≥10確定定量下限(LOQ).得出阿莫西林在奶中的檢出限為1μg·kg-1，定量下限為2μg·kg-1，滿足殘留檢測(cè)的要求.

2.4 回收率和精密度

回收率和精密度的計(jì)算，采用在空白奶樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行檢測(cè)，其多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜圖如圖1所示.由表1可知，阿莫西林在奶中的平均回收率介于75.6% ～91.0%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6% ～10.2%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 3.5% ～8.2%，滿足獸藥殘留檢測(cè)方法的要求.

2.5 抽樣檢測(cè)

抽樣(牛、羊奶各15份)檢測(cè)結(jié)果顯示，2份牛奶檢測(cè)出6μg·kg-1的殘留(未超過(guò)殘留限量，阿莫西林在奶的MRL為10μg·kg-1)，1份羊奶檢測(cè)出15μg·kg-1的阿莫西林殘留(超過(guò)了殘留限量)，其余樣品未檢測(cè)出阿莫西林殘留.表明該方法可檢測(cè)牛奶和羊奶中阿莫西林的殘留量，在生產(chǎn)實(shí)際中可用于檢測(cè)奶中阿莫西林的殘留.

圖1 空白(A、B)和空白添加阿莫西林(a、b，2μg·kg-1)奶樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜圖Fig.1 MRM chromatogram of blank milk samples(A，B)and spiked with amoxicillin at2 μg·kg-1(a，b)

表1 奶中阿莫西林的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Tab.1 Recoveries and relative standard deviations(RSD)of amoxicillin spiked in m ilk(n=5)

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

阿莫西林的極性較小，是有機(jī)弱酸性物質(zhì)，在C18色譜柱上能較好地保留.研究考察了Gemini C18(150 mm×4.6 mm，粒徑3.5μm)和Luna C18(2.1 mm×150 mm，粒徑5μm)2種色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)在Gemini C18色譜柱上藥物峰形寬大，分離效果差，而且柱壓較高，不予采用，因此采用Luna C18(2.1 mm×150 mm，粒徑5μm)色譜柱.本試驗(yàn)流動(dòng)相的有機(jī)相成分為乙腈，在水相中加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸［22］使阿莫西林的響應(yīng)值更高，峰形尖銳，分離度更好.說(shuō)明甲酸促進(jìn)了阿莫西林的離子化.

3.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

分析樣品中阿莫西林殘留的方法有微生物測(cè)定法、免疫分析法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等.通過(guò)文獻(xiàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn):微生物法由于動(dòng)物源性食品中干擾物質(zhì)多，且具備抑菌作用的抗生素種類繁多，使其結(jié)果假陽(yáng)性率較高，準(zhǔn)確性較差，而且缺乏特異性.高效液相色譜法測(cè)定青霉素類藥物殘留通常用反相液相色譜法，紫外檢測(cè)器進(jìn)行定量.但由于測(cè)定波長(zhǎng)在200～235 nm，基體干擾明顯，無(wú)法應(yīng)用于實(shí)際樣品中藥物含量測(cè)定.人們開發(fā)了測(cè)定衍生化青霉素的方法，通過(guò)提高檢測(cè)波長(zhǎng)來(lái)消除基體干擾［4］.但實(shí)際樣品中阿莫西林殘留分析之前，都要經(jīng)過(guò)繁瑣費(fèi)時(shí)的衍生化［1-2，4，10-11］過(guò)程.液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法采用多離子通道系統(tǒng)進(jìn)行藥物分析，分離能力強(qiáng)，精確可靠，用于測(cè)定阿莫西林的殘留時(shí)避免了衍生化的繁瑣步驟，但都要用SPE柱進(jìn)行凈化［13-18，20-21］，所需試劑的種類和數(shù)量較多，成本較高.本研究運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)檢測(cè)奶中阿莫西林的殘留，通過(guò)8 mL乙醇提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.5 mL后用乙酸銨溶液定容，正己烷凈化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的處理，該方法操作簡(jiǎn)單快速，避免了衍生化和SPE柱凈化的繁瑣步驟，前處理過(guò)程僅需要乙醇、乙酸銨和正己烷3種試劑，成本較低，效率高(單個(gè)樣品前處理時(shí)間在40 min左右)，適用于生產(chǎn)實(shí)踐中大批量樣品的快速檢測(cè).

3.3 提取液的選擇

已報(bào)道的文獻(xiàn)資料中，用來(lái)沉淀牛奶中蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑主要有乙腈［1，12，17-18］和三氯乙酸［2，10］，也有采用乙酸鉛［14］的報(bào)道.這些報(bào)道的樣品前處理方法中，大部分都包含了操作繁瑣的固相萃取(SPE)凈化步驟.本試驗(yàn)采用乙腈、甲醇和乙醇［19］來(lái)去除奶中的蛋白質(zhì).結(jié)果顯示乙醇沉淀蛋白質(zhì)的效果最好，阿莫西林的回收率較高(75% 以上)，而乙腈和甲醇沉淀蛋白質(zhì)后阿莫西林的回收率在60%左右.由于阿莫西林不穩(wěn)定，為了防止目標(biāo)物降解，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約0.5 mL 后，分別加入 pH 為 3.0、4.5、5.0、6.0 的乙酸銨溶液，考察其提取效果，試驗(yàn)結(jié)果表明阿莫西林在pH 4.5的乙酸銨溶液中最穩(wěn)定，回收率最高.由于離子濃度對(duì)阿莫西林有一定影響，比較了10與50 mmol·L-1乙酸銨溶液提取結(jié)果的回收率，發(fā)現(xiàn)10 mmol·L-1乙酸銨溶液回收率高于50 mmol·L-1乙酸銨溶液.樣品提取溶液經(jīng)過(guò)高速低溫離心和0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，檢測(cè)結(jié)果表明樣品提取溶液足夠干凈，不會(huì)對(duì)阿莫西林的檢測(cè)產(chǎn)生顯著的干擾.

3.4 濃縮條件的選擇

本試驗(yàn)運(yùn)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式去除提取溶液中的乙醇，對(duì)阿莫西林進(jìn)行濃縮.阿莫西林本身不穩(wěn)定，在溶液條件下會(huì)加速阿莫西林的降解，提高蒸發(fā)濃縮的溫度會(huì)加快乙醇的揮發(fā)，同時(shí)也會(huì)加速阿莫西林的降解.因此選擇在30、37和40℃條件下進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn).發(fā)現(xiàn)在37℃條件下濃縮效率高(單個(gè)樣品蒸發(fā)濃縮至0.5 mL需要6 min)，方法的回收率也較高(75%以上).本試驗(yàn)同時(shí)嘗試將提取液完全吹干，由于耗時(shí)較長(zhǎng)，阿莫西林的降解導(dǎo)致方法回收率降低(回收率只有50% ～60%)，處理方法上采用了在37℃條件下蒸發(fā)濃縮至0.5 mL的方式.

3.5 基質(zhì)效應(yīng)的消除

樣品基質(zhì)溶液對(duì)目標(biāo)物的電噴霧離子化有很大影響，可增強(qiáng)或抑制信號(hào)響應(yīng)，進(jìn)而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度［23］.本試驗(yàn)通過(guò)在空白奶基質(zhì)提取液中添加低、中、高 3個(gè)質(zhì)量濃度即 5、50、200 μg·L-1的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液，與純?nèi)軇┲械男盘?hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，奶基質(zhì)峰面積與純?nèi)軇┑姆迕娣e比值為70%～86%，說(shuō)明牛奶和羊奶基質(zhì)對(duì)阿莫西林檢測(cè)均有抑制效應(yīng).為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法［24］進(jìn)行校準(zhǔn).

3.6 結(jié)論

本文建立了HPLC-MS/MS法測(cè)定奶中阿莫西林殘留量的分析方法.樣品經(jīng)乙醇提取，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用乙酸銨溶液復(fù)溶，復(fù)溶液用正己烷去除脂肪后，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析.本方法前處理操作簡(jiǎn)便易行，不需要SPE柱凈化，所需試劑較少，成本較低;同HPLC法相比，HPLC-MS/MS法避免了衍生化和SPE柱凈化的繁瑣步驟，而且精密度和重復(fù)性好，靈敏度高，定量限低于歐盟對(duì)奶中阿莫西林制定的最高殘留限量，適用于奶中阿莫西林的殘留檢測(cè).

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【責(zé)任編輯 柴 焰】