南方泡桐二倍體及其同源四倍體AFLP 和MSAP 的差異1)

張曉申 范國強(qiáng) 鄧敏捷 董焱鵬 趙振利

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州，450002)

多倍化是植物進(jìn)化過程中的一種普遍現(xiàn)象。自然界大約70%的被子植物在進(jìn)化史中經(jīng)歷過一次以上的多倍化過程［1－2］。植物染色體數(shù)增加后，基因的劑量和互作效應(yīng)往往會(huì)導(dǎo)致植物一系列的生理生化功能的改變，其最明顯特征表現(xiàn)為器官和生物量的增大以及適應(yīng)生物和非生物脅迫能力的提高［3－4］。研究表明，擬南芥［5］、小麥［6－7］、水稻［8］、棉花［9］和黃瓜［10］多倍化后，DNA 甲基化水平和甲基化模式都發(fā)生了變化。然而，這些研究多集中在農(nóng)作物和1年生草本植物［11－12］，而有關(guān)木本植物的研究則相對(duì)較少［13－14］。泡桐(Paulownia)是我國重要的速生用材和綠化樹種之一，然而，泡桐生產(chǎn)中存在的叢枝病發(fā)生嚴(yán)重和“低干大冠”等問題，嚴(yán)重影響了農(nóng)民種植泡桐的積極性和泡桐產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近年來，我們創(chuàng)新了多個(gè)四倍體泡桐新種質(zhì)［15－20］，一方面豐富了泡桐種質(zhì)資源，另一方面也為篩選出符合人們意愿的泡桐新品種提供了材料支撐。過去，雖然科技工作者開展過四倍體泡桐葉片結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)和木材特性等方面研究工作［21－22］，但至目前還未見國內(nèi)外有關(guān)泡桐二倍體及其同源四倍體遺傳關(guān)系研究的報(bào)道。為了弄清南方泡桐二倍體染色體加倍前后DNA 的變化情況，闡明南方泡桐四倍體優(yōu)良特征的分子機(jī)制，本文利用DNA 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)和DNA 甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)技術(shù)研究南方泡桐二倍體及其同源四倍體的DNA 堿基序列及其甲基化變化，以期為南方泡桐四倍體大面積推廣提供理論支撐。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐研究所經(jīng)體胚發(fā)生途徑獲得，并培養(yǎng)30 d 的南方泡桐二倍體及其同源四倍體組織培養(yǎng)苗。剪取適量生長(zhǎng)狀況良好、大小一致幼苗長(zhǎng)0.3 ～0.5 cm 的頂芽用液氮冷凍后放于冰箱內(nèi)－86 ℃?zhèn)溆?。組培苗培養(yǎng)溫度為(25±2)℃、光照強(qiáng)度2 000 lx、光照時(shí)間16 h·d－1。

泡桐DNA 的提取:南方泡桐二倍體及其同源四倍體DNA 的提取參照張延召等［23］方法。

AFLP 和MSAP 擴(kuò)增:南方泡桐二倍體及其同源四倍體DNA 的AFLP 和MSAP 擴(kuò)增所需96 對(duì)引物組合的堿基序列、擴(kuò)增程序及其產(chǎn)物的電泳分別參照曹喜兵等［24－25］法。

電泳凝膠的譜帶分析:電泳結(jié)束后，對(duì)用硝酸銀染色的膠板譜帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中，H 和M 分別為EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ雙酶切產(chǎn)物電泳譜帶，每一條譜帶代表一個(gè)酶切位點(diǎn)，將譜帶有或無分別記作1 或0。每個(gè)DNA 樣品的H 和M 擴(kuò)增譜帶可劃分為4 種［種類I(H，M=1，1)，無甲基化發(fā)生;種類Ⅱ(H，M=1，0)，單鏈DNA 外甲基化;種類Ⅲ(H，M=0，1)，雙鏈DNA 內(nèi)甲基化;種類IV(H，M=0，0)，雙鏈DNA 外甲基化］。DNA 甲基化類型分為多態(tài)性和單態(tài)性類型。DNA 多態(tài)性類型為甲基化型(A)、去甲基化型(B)和不定型(C)。其中，A 型中的A1 和A2 代表DNA 重新甲基化(對(duì)照樣H 和M 泳道均有帶，而處理樣僅H 或M 泳道有帶);A3和A4 代表DNA 超甲基化(對(duì)照樣僅H 或M 有1 條帶，而處理樣H 和M 泳道都沒帶)。B 型(Bl、B2、B3 和B4)代表DNA 去甲基化，DNA 甲基化譜帶與A 型相反。C 型代表DNA 甲基化的不確定性(對(duì)照樣與處理樣DNA 甲基化差異譜帶無法確定)。單態(tài)性類型為D 型(對(duì)照樣與處理樣間DNA 譜帶相同)。同時(shí)，計(jì)算樣品的總DNA 甲基化水平［(種類II 譜帶數(shù)量+種類Ⅲ譜帶數(shù)量)/(種類I 譜帶數(shù)量+種類II 譜帶數(shù)量+種類III 譜帶數(shù)量)×100%］和總DNA 甲基化多態(tài)性［(A 型譜帶數(shù)量+B 型譜帶數(shù)量+C 型譜帶數(shù)量)/(A 型譜帶數(shù)量+B 型譜帶數(shù)量+C型譜帶數(shù)量+D 型譜帶數(shù)量)×100%］及DNA 單態(tài)性［D 型譜帶數(shù)量/(A 型譜帶數(shù)量+B 型譜帶數(shù)量+C 型譜帶數(shù)量+D 型譜帶數(shù)量)×100%］。

2 結(jié)果與分析

2.1 南方泡桐二倍體染色體加倍后DNA 的堿基序列變化

南方泡桐二倍體及其同源四倍體DNA 的AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果(圖1)表明，雖然南方泡桐二倍體及其同源四倍體DNA 經(jīng)不同引物擴(kuò)增后產(chǎn)生的片段大小和數(shù)量存在一定的差異，但同一引物擴(kuò)增后產(chǎn)生了數(shù)量相同和長(zhǎng)度一致的DNA 片段，并且每對(duì)引物平均可擴(kuò)增出50 ～70 條譜帶。也就是說，南方泡桐二倍體及其同源四倍體DNA 的AFLP 酶切位點(diǎn)沒有發(fā)生變化。該結(jié)果說明，南方泡桐二倍體及其同源四倍體的DNA 堿基序列在AFLP 水平上是相同的。

圖1 南方泡桐二倍體及其同源四倍體的AFLP 擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 南方泡桐二倍體及其同源四倍體的DNA 甲基化差異

2.2.1 南方泡桐二倍體及其同源四倍體DNA 甲基化水平的差異

南方泡桐二倍體及其同源四倍體的MSAP 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果(表1)表明，南方泡桐同源四倍體總DNA 甲基化水平高于其二倍體。南方泡桐二倍體DNA 的MSAP 擴(kuò)增位點(diǎn)為2 059 個(gè)，其中全甲基化位點(diǎn)數(shù)為201 個(gè)(占總擴(kuò)增帶數(shù)的9.76%)，半甲基化位點(diǎn)數(shù)為506 個(gè)(占總擴(kuò)增位點(diǎn)的24.58%)，總甲基化位點(diǎn)為707 個(gè)(占總擴(kuò)增帶數(shù)的34.34%);南方泡桐同源四倍體的擴(kuò)增位點(diǎn)為2214 個(gè)，其中全甲基化位點(diǎn)數(shù)為260 個(gè)(占總擴(kuò)增帶數(shù)的11.74%)，半甲基化位點(diǎn)數(shù)為554 個(gè)(占總擴(kuò)增位點(diǎn)的25.02%)，總甲基化位點(diǎn)為814 個(gè)(占總擴(kuò)增帶數(shù)的36.77%)。此外，南方泡桐二倍體及其同源四倍體的CCGG 位點(diǎn)均以雙鏈全甲基化(CmCGG)為主，并且南方泡桐同源四倍體DNA 全甲基化和半甲基化水平皆高于其二倍體。結(jié)合南方泡桐二倍體染色體加倍前后DNA 堿基序列變化情況可以推出，南方泡桐同源四倍體DNA 甲基化水平升高可能是其生物學(xué)和木材理化性質(zhì)未呈現(xiàn)倍增的主要原因之一。

表1 南方泡桐二倍體及其同源四倍體總DNA 甲基化水平

2.2.2 南方泡桐二倍體及其同源四倍體DNA 甲基化模式的差異

由南方泡桐二倍體及其同源四倍體DNA 的MSAP 擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果(圖2)和譜帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表2)可以看出，南方泡桐二倍體染色體加倍前后的DNA 甲基化模式發(fā)生了變化。南方泡桐二倍體DNA 甲基化(A 型)位點(diǎn)數(shù)為281(占總甲基化多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)的15.47%)，去甲基化(B 型)位點(diǎn)數(shù)為449(占總甲基化多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)的24.72%)。去甲基化(C型)位點(diǎn)數(shù)為11(占總甲基化多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)的0.61%)，與南方泡桐二倍體相比，其四倍體總甲基化多態(tài)性比率為40.80%，甲基化單態(tài)性(D 型)位點(diǎn)數(shù)1075(占總甲基化多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)的59.20%)。該結(jié)果說明，南方泡桐同源四倍體DNA 甲基化模式變化頻率小于其二倍體，并且南方泡桐同源四倍體DNA 去甲基化模式發(fā)生的頻率高于其發(fā)生甲基化的頻率。

圖2 南方泡桐二倍體及其同源四倍體的MSAP 擴(kuò)增產(chǎn)物

表2 南方泡桐二倍體及其同源四倍體DNA 甲基化模式

3 結(jié)論與討論

多倍化是推動(dòng)植物進(jìn)化和新物種形成的重要?jiǎng)恿?。根?jù)加倍染色體的起源，科技工作者將多倍體劃分為同源多倍體和異源多倍體［26－28］，四倍體是多倍體中最常見的類型之一［26］。近30 a 來，人們已對(duì)異源四倍體與其對(duì)應(yīng)二倍體的遺傳變異進(jìn)行過大量的研究［3，26－31］，而對(duì)同源四倍體的研究則相對(duì)較少［3］。研究表明，同源四倍體植株具有器官和生物量增大的明顯特征及較強(qiáng)適應(yīng)生物和非生物脅迫的能力［3－4］，這些變化必然與染色體加倍后植物DNA的變化有一定的聯(lián)系。植物染色體加倍前后，DNA堿基序列及其甲基化變化情況，不同研究者得出的結(jié)果不完全相同。焦鋒等［32］利用RAPD 技術(shù)分析了桑樹(Morus alba L.)二倍體和同源四倍體的DNA指紋，沒有發(fā)現(xiàn)差異條帶;趙衛(wèi)國等［33］和林強(qiáng)等［34］分別利用ISSR 和PARD 技術(shù)研發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桑8 號(hào)(Nongsang 8)和湖桑199 號(hào)(Husang 199)的二倍體及其同源四倍體間擴(kuò)增條帶完全相同;欒麗等［35］發(fā)現(xiàn)的研究結(jié)果表明，水稻(Oryza sativa)二倍體及其四倍體DNA 堿基序列在SSR 水平上沒有發(fā)生變化;聶麗娟等［36］利用AFLP 沒有檢測(cè)到西瓜(Citrullus lamatus)二倍體和同源四倍體間DNA 堿基序列的差異;土豆(Solanum tuberosum)二倍體染色體加倍前后DNA 堿基序列的變化情況也是如此［37］。但是，劉文革等［38］和王卓偉等［39］利用AFLP 研究發(fā)現(xiàn)，西瓜(Citrullus lanatus)和桑樹(Morus alba L.)二倍體染色體加倍前后DNA 堿基序列發(fā)生了明顯變化，類似結(jié)果在黃瓜(Cucumis sativus L.)二倍體及其同源四倍體的研究中得到［40］。本研究中，我們利用AFLP 分析發(fā)現(xiàn)，南方泡桐二倍體及其染色體加倍后的DNA 堿基序列沒有發(fā)生變化。我們認(rèn)為，造成該結(jié)果的原因可能與不同研究者在誘導(dǎo)同源四倍體過程中使用不同劑量誘變劑和不同時(shí)間跨度的試驗(yàn)材料有一定關(guān)系。如果使用的誘變劑濃度過大，必然引起DNA 結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致同源四倍體染色體的重組或基因重排［41－42］、染色體不等交換及DNA 堿基序列丟失［42－43］情況的發(fā)生，從而出現(xiàn)DNA 譜帶的變化［37］。此外，植物染色體加倍后，植株細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了核質(zhì)不平衡等現(xiàn)象，但又要適應(yīng)環(huán)境條件，完成生長(zhǎng)發(fā)育生活周期，迫使植物作出適宜的形態(tài)和遺傳變化［44－46］。同源四倍體獲得的時(shí)間越短，DNA堿基序列的一致性越高，用AFLP 等技術(shù)檢測(cè)出差異性的可能性越小，但由于染色體加倍造成的DNA甲基化變化始終存在，故出現(xiàn)MSAP 片段多態(tài)性就是必然的［47］。同源四倍體植物獲得的時(shí)間越長(zhǎng)，DNA 堿基序列變化可能性越大，故就較容易用AFLP 和MSAP 檢測(cè)出染色體加倍前后DNA 堿基序列及其甲基化的變化情況［9－12］。在此需要說明的是，雖然AFLP 較能準(zhǔn)確反映DNA 堿基序列的變化，但其檢測(cè)的畢竟仍是DNA 片段。故要證明二倍體及其同源四倍體南方泡桐間DNA 堿基序列是否發(fā)生變化還需在DNA 單堿基(SNP)水平上開展研究。

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