生防芽孢桿菌的應(yīng)用研究進(jìn)展

葉晶晶,曹寧寧,吳建梅,胡祚忠,張劍飛

(1 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所，四川 南充 637000；2 四川省南充蠶種場，四川 南充 637000)

化學(xué)防治在植物病蟲害防治中一直發(fā)揮著重要作用，但長期大量地使用化學(xué)農(nóng)藥，則帶來了環(huán)境污染、生態(tài)平衡被破壞等一系列嚴(yán)重問題。因此，探尋對人類和環(huán)境友好并具有良好防治效果的新型植物病蟲害防治策略尤為重要。

自然界廣泛存在的與植物病原微生物密切相關(guān)的拮抗微生物，是植物病害生物防治的一個重要組成部分，相關(guān)研究始于1921年的利用真菌防治猝倒病(Pythiumdebaryanum,damping-off)[1]，之后尋找有益微生物防治植物病害便成為新型生物農(nóng)藥研究的一個重要方向。生物農(nóng)藥既可避免農(nóng)藥殘留對人畜的危害，又能促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。作為具有生防應(yīng)用價值的拮抗菌之一，芽孢桿菌(Bacillus)因培養(yǎng)周期短、生產(chǎn)方便而日益成為生防菌的優(yōu)勢菌源[2]。芽孢桿菌是一類產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，好氧或兼性厭氧生活，能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和抗有機溶劑的內(nèi)生孢子，所產(chǎn)芽孢可制成粉劑、可濕性粉劑等各種劑型，且與化學(xué)農(nóng)藥混用后不失活，是理想的生防菌篩選對象[3]。已報道的生防芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌(B.subtilies)、多粘芽孢桿菌(B.polymyxa)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、蕈狀菌變種(B.cereusvar.mycoides)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)和短小芽孢桿菌(B.pumilus)等。本文主要從芽孢桿菌的生防作用機制、應(yīng)用現(xiàn)狀及存在問題等方面進(jìn)行綜述，并對相關(guān)研究趨勢進(jìn)行了展望，以期進(jìn)一步擴大芽孢桿菌在新型農(nóng)藥研發(fā)中的應(yīng)用。

1 芽孢桿菌的生防作用形式及機制

芽孢桿菌的生防作用主要有拮抗作用、競爭作用、誘導(dǎo)抗性和促生作用等幾種形式，其對植物病原菌的抑制并非由某一種形式發(fā)揮作用，而是2種或多種形式協(xié)同作用的結(jié)果[4]。

1.1 拮抗作用

拮抗作用是指一種微生物產(chǎn)生的物質(zhì)抑制或殺死另一種微生物的作用[5]。芽孢桿菌種類眾多，可產(chǎn)生多種不同的代謝產(chǎn)物，如細(xì)菌素、酶類、脂肽等，對病原微生物均可表現(xiàn)出拮抗作用。

1.1.1 細(xì)菌素的作用 芽孢桿菌能產(chǎn)生細(xì)菌素Subtilin和Subtilosin，屬于抗菌肽類。Foldes等[6]從谷類的根際分離到1株枯草芽孢桿菌IFS201，其對食品腐敗病原菌中的霉菌、酵母、細(xì)菌都有一定的抑制作用。

1.1.2 酶類及蛋白類抑菌物質(zhì)的作用 芽孢桿菌在生長代謝過程中會分泌一些抑制植物病原物的酶類或活性蛋白，具有很好的生防作用。結(jié)構(gòu)不同的抗菌物質(zhì)抑菌機理也不同，而某些菌株分泌的多種結(jié)構(gòu)相似的抗菌物質(zhì)則會表現(xiàn)出協(xié)同的抑菌效果[7]。芽孢桿菌所產(chǎn)生的酶類主要包括溶菌酶[8]、氨基酸轉(zhuǎn)移酶[9]、酰胺酶[10]、纖溶酶[11]和氧化酶(β-瓊脂糖酶、NADH氧化酶)[12-13]等，這些酶可以抑制病原菌的生長；Avinash等[14]和Alya等[15]分別對2種蠟狀芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物青霉素?；D(zhuǎn)移酶和多糖水解蛋白酶進(jìn)行了研究，證明這些酶類通過抑制、降解或水解其他的病原體，起到生物防治的作用；邢介帥等[16]研究發(fā)現(xiàn)，分離純化的枯草芽孢桿菌T2所產(chǎn)生的蛋白酶，對棉花枯萎病菌菌絲生長具有抑制作用，推測可能是蛋白酶降解了枯萎病菌細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)，造成細(xì)胞壁缺損，在膨脹壓的作用下使菌體發(fā)生了變形。

抗菌蛋白對植物病原菌的抑制作用機制包括抑制病原菌孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)，導(dǎo)致菌絲畸形、細(xì)胞壁溶解和原生質(zhì)泄漏等。馬桂珍等[17]從多粘類芽孢桿菌L1-9 菌株發(fā)酵液中分離純化出一種對金黃色葡萄球菌和小麥蠕孢病菌的菌絲生長及孢子萌發(fā)具有抑制作用的抗菌蛋白，分子質(zhì)量約為31 ku；王笑穎等[18]研究發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌拮抗細(xì)菌多粘芽孢桿菌7-4菌株所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)均為蛋白(或多肽)；李晶等[19]從枯草芽孢桿菌B29菌株的發(fā)酵上清液中分離純化得到抗菌蛋白B29I，分子質(zhì)量約為42.30 ku，該蛋白可使黃瓜枯萎病菌孢子的萌發(fā)時間推遲，并可強烈抑制芽管伸長。

1.1.3 脂肽類物質(zhì)的作用 在植物病害的生物防治中，由芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的具有抗菌活性的脂肽類物質(zhì)起到了重要作用，這類物質(zhì)主要分為3大家族：表面活性素(surfactins)、伊枯草菌素(iturins)和豐寧素A、B(fengycins)[20]；另外，還有環(huán)肽抗生素如枯草芽孢桿菌 TG226產(chǎn)生的一種新的抗真菌小肽LP1[21]。脂肽類抗生素的作用原理是其對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)特性的影響，通過改變細(xì)胞膜通透性抑制病原菌的生長[22]，其中表面活性素還具有抗病毒[23]、抗真菌[24]和抗細(xì)菌活性，逐漸受到工業(yè)、生物技術(shù)和醫(yī)療應(yīng)用方面的關(guān)注。陳華等[25]從枯草芽孢桿菌JA發(fā)酵液中分離出豐寧素，體外抗菌試驗表明，該物質(zhì)能夠抑制多種重要植物病原真菌的生長；張桂英等[26]通過研究拮抗菌對甘蔗黑穗病菌的拮抗作用發(fā)現(xiàn)，其抗菌作用機制與伊枯草菌素的產(chǎn)生有關(guān)；黃曦等[27]研究發(fā)現(xiàn)，由枯草芽孢桿菌ON-6代謝產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)對荔枝炭疽菌具有抑制效果；Yanez Mendizabal等[28]研究發(fā)現(xiàn)，由枯草芽孢桿菌 CPA-8 代謝所產(chǎn)生的類豐寧素家族的脂肽對桃褐腐病病菌也具有顯著的拮抗作用。

1.2 競爭作用

近年來，隨著分子生物學(xué)和生化分析技術(shù)的發(fā)展，一些新技術(shù)和儀器被用于競爭作用的研究，如掃描電鏡觀察、熒光標(biāo)記、ELISA、PCR等。競爭作用是生防微生物發(fā)揮作用的重要機制之一。芽孢桿菌的競爭作用主要包括營養(yǎng)競爭和空間位點競爭，而且以空間位點競爭為主，主要作用方式為在植物根際、體表或體內(nèi)及土壤中定殖。何紅等[29]研究表明，枯草芽孢桿菌BS22和BS21菌株可通過浸種、灌根和涂葉等接種方法進(jìn)入番茄等多種非自然宿主植物體內(nèi)定殖；Bacon等[30]分離的玉米內(nèi)生枯草芽孢桿菌與玉米病原真菌串珠鐮孢菌(Fusariummoniliforme)有相同的生態(tài)位，枯草芽孢桿菌能在玉米體內(nèi)迅速定殖和繁殖，可有效降低串珠鐮孢菌及其毒素的積累；郭榮君等[31]利用營養(yǎng)競爭平板篩選法，篩選到2株可完全抑制尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)菌絲生長的枯草芽孢桿菌菌株，對真葉期大豆根腐病有很好的防治效果，并能提高大豆產(chǎn)量；曹君等[32]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BS菌株活菌液對棉花枯萎病的抑菌率在70%以上，而菌株代謝液的抑菌率較低，說明BS菌株對棉花枯萎病的作用主要通過營養(yǎng)競爭的方式實現(xiàn)；黎起秦等[33]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌B47菌株主要在番茄維管束中定殖，從而抑制番茄內(nèi)生病菌的生長；Timmusk等[34]在研究多粘類芽孢桿菌B1和B2時發(fā)現(xiàn)，菌株在擬南芥根部細(xì)胞間隙定殖，并形成生物保護(hù)膜，有效地防止了擬南芥病害菌的侵入，粘類芽孢桿菌MB02-1007[35]、GBR-462[36]和B5[37]亦是通過這種機制來有效防治植物病害的。

1.3 誘導(dǎo)抗性作用

誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性是生防細(xì)菌發(fā)揮生防作用的一個重要方面。芽孢桿菌不但能直接抑制植物病原菌，而且能通過誘發(fā)植物自身的抗病潛能而增強植物的抗病性。FZB24(r)可產(chǎn)生與植物抗性蛋白合成基因表達(dá)相關(guān)的信號蛋白來誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，也可通過分泌相關(guān)蛋白如絲氨酸專性肽鏈內(nèi)切酶直接誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性[38]。李德全等[39]通過對生防菌Bs2916進(jìn)行誘變，篩選到4株拮抗性提高15%以上的菌株(與未誘變的Bs2916de抗性相比)，而且Bs2916及其突變菌株分泌的活性物質(zhì)對水稻具有誘導(dǎo)抗性作用，使得水稻植株體內(nèi)的過氧化物酶、多酚氧化酶和超氧化物歧化酶3種酶的活性增強。

1.4 促生作用

在植物根際生活、可刺激植物生長和抑制植物病原菌的細(xì)菌群，被稱作促進(jìn)植物生長根際細(xì)菌(PGPR)。部分芽孢桿菌即屬于促進(jìn)植物生長根際細(xì)菌，可通過自身合成多種不同的生長激素來促進(jìn)植物的生長，且在極低濃度下就可產(chǎn)生明顯的生理效應(yīng)并影響植物的生長態(tài)勢，從而起到防止病害發(fā)生的作用。

芽孢桿菌合成的生長激素類物質(zhì)主要有生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸和吲哚乙酸等[40-42]。Faltin等[43]建立了篩選對立枯絲核菌有抗性作用并可產(chǎn)生吲哚乙酸的植物有益菌的平板微孔法，用這種方法發(fā)現(xiàn)，有益菌分泌的植物激素可以明顯促進(jìn)萵苣葉片伸長；張霞等[44]在試驗中發(fā)現(xiàn)，添加枯草芽孢桿菌B931后，甘薯苗的發(fā)根數(shù)和根長均顯著增加；蔡學(xué)清等[45]對辣椒內(nèi)生枯草芽孢桿菌BS-2的研究證明，BS-2對辣椒苗有明顯的促生作用，而且可誘導(dǎo)辣椒體內(nèi)吲哚乙酸等促生長激素的生成，并可降低脫落酸等抑制植物生長激素的含量。

2 芽孢桿菌的生防應(yīng)用現(xiàn)狀

芽孢桿菌作為防治植物病害的生防因子之一，從20世紀(jì)80年代起，一些優(yōu)良的生防菌株便已進(jìn)入工廠化生產(chǎn)，并開始較大規(guī)模地在田間推廣應(yīng)用，其中以研發(fā)的枯草芽孢桿菌制劑尤為突出。

2.1 應(yīng)用成果

目前已有很多優(yōu)良的芽孢桿菌菌株應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。美國已有4株芽孢桿菌生防菌株(QST713、GB03、MBI600和FZB24)得到了美國環(huán)保署(EPA)商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可；國內(nèi)利用芽孢桿菌防治植物病害的應(yīng)用研究也達(dá)到了世界先進(jìn)水平，現(xiàn)已開發(fā)成功并投入生產(chǎn)的商品制劑有亞寶、百抗、麥豐寧、紋曲寧等。

2.2 存在問題

2.2.1 生防效果不穩(wěn)定 在生態(tài)系統(tǒng)中引入生防菌，其能否適應(yīng)被引入的生態(tài)環(huán)境，能否在受病原菌侵染的植物上定殖并穩(wěn)定增殖，以及其與相應(yīng)病原物的競爭，成為了防治病害的關(guān)鍵。同時，拮抗菌生防效果受到生態(tài)適應(yīng)性、環(huán)境抗逆性以及作用時間等的限制，使得芽孢桿菌生長不穩(wěn)定，分泌的有效殺菌物質(zhì)被降解，因此防治效果不穩(wěn)定。

2.2.2 有益微生物的局限性 有益微生物一般生活在特定的環(huán)境(包括土壤類型、溫度、pH及土壤生態(tài)系統(tǒng)等)中。因此，應(yīng)解決生防菌對環(huán)境適應(yīng)性較窄，且有的菌株對農(nóng)藥反應(yīng)敏感、抗病譜窄等問題。

2.2.3 拮抗和促生作用結(jié)合較難 拮抗作用是衡量生防效果的重要指標(biāo)之一。試驗證明，在許多植株的根際或葉面存在對植株有促生作用的微生物[46]，而如何使拮抗和促生效果有機結(jié)合，仍是生防研究的難題。

2.3 解決方法

鑒于以上問題，建議從以下幾個方面進(jìn)行解決：

(1)與化學(xué)農(nóng)藥配合使用。施用農(nóng)藥可幫助芽孢桿菌克服定殖過程中與其他微生物群落的競爭，形成優(yōu)勢種群，同時發(fā)揮化學(xué)藥劑抑菌迅速、防效穩(wěn)定的優(yōu)勢，通過協(xié)同作用達(dá)到優(yōu)勢互補、用量減少、防效增強的目的[47]。

(2)對有益微生物進(jìn)行改造。采用基因工程、誘變育種的方法，對有益微生物進(jìn)行改造，獲得營養(yǎng)競爭能力強、抗菌物質(zhì)產(chǎn)量高、生長速度快、適應(yīng)性強的理想生防工程菌株，這也是生防菌應(yīng)用領(lǐng)域的研究重點[48]。目前，通過遺傳改良構(gòu)建的工程菌兼具殺蟲、防病等作用，且遺傳性狀穩(wěn)定[49-52]。

(3)與其他拮抗微生物協(xié)同互作。通過互作實現(xiàn)多種抗生菌功能互補、多種病害兼防、作用持久的協(xié)同控病效果[53]，如將沒有拮抗、寄生、溶解或競爭等互斥關(guān)系的2種以上的拮抗微生物混合，有利于混合菌株對植物不同部位的空間進(jìn)行全面占領(lǐng)；同時由于混合菌劑能適應(yīng)不同的環(huán)境條件，可在更大的光、溫、氣、濕度變幅內(nèi)生存繁衍，可以更好地發(fā)揮菌株的協(xié)同控病效果。

3 展 望

利用拮抗微生物防治植物病害是當(dāng)今植物病理學(xué)界十分活躍的研究領(lǐng)域之一。實踐證明，引入對病原菌有拮抗作用的微生物防治植物病害，是一種經(jīng)濟有效且無副作用的防治途徑。芽孢桿菌微生物殺菌劑具有對人畜安全、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性、高效廣譜、促進(jìn)作物生長等優(yōu)點，因而更符合現(xiàn)代社會對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及有害生物綜合防治的要求和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略目標(biāo)，同時有較強的市場競爭力和良好的經(jīng)濟效益，能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益，將會有無限的應(yīng)用前景。因此，在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，如何運用芽孢桿菌來防治植物病害已成為一個備受關(guān)注的熱點[54]。

目前，對芽孢桿菌抗菌作用的分子機制、拮抗基因的克隆及其表達(dá)調(diào)控、誘導(dǎo)抗性的生理及分子機制等研究已經(jīng)積累了豐富的資料，這對于指導(dǎo)利用芽孢桿菌開發(fā)生防菌劑具有重要的理論意義和生產(chǎn)價值。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組測序等新興技術(shù)方法的發(fā)展及先進(jìn)儀器設(shè)備的出現(xiàn)，今后將會開發(fā)出更多的新型高效生防制劑。

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