ldhA基因敲除對Corynebacterium glutamicumTCCC11822發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的影響

張成林，李志華，梁靜波，徐慶陽*

（1.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津300457；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

ldhA基因敲除對Corynebacterium glutamicumTCCC11822發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的影響

張成林1，2，3，李志華1，梁靜波1，2，3，徐慶陽1，2，3*

（1.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津300457；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

針對L-谷氨酸發(fā)酵過程中乳酸產(chǎn)量偏高的問題，以L-谷氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）TCCC11822為出發(fā)菌株，通過構(gòu)建敲除質(zhì)粒pK18mobsacB△ldh并采用同源重組技術(shù)敲除其乳酸脫氫酶編碼基因ldhA，以期達到減少副產(chǎn)物、提高L-谷氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的目的。結(jié)果表明，與出發(fā)菌株相比ldhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6%，L-谷氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高7.6%和5.5%，但生物量略有下降。本研究可為L-谷氨酸及其他氨基酸生產(chǎn)菌株的理性改造提供參考。

L-谷氨酸；乳酸；乳酸脫氫酶；基因敲除

L-谷氨酸又名α-氨基戊二酸，是大宗氨基酸品種之一，因其具有增鮮作用而被廣泛用于味精、雞精等調(diào)味劑的生產(chǎn)。此外，L-谷氨酸還具有降低血氨、改善神經(jīng)系統(tǒng)和兒童智力發(fā)育以及增強血液循環(huán)等功能，并被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域[1-3]。

自1957年采用谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸以來，其產(chǎn)量和生產(chǎn)規(guī)模不斷擴大，目前世界L-谷氨酸年產(chǎn)量已超過250萬t[4]。乳酸是L-谷氨酸發(fā)酵過程中常見副產(chǎn)物之一，由丙酮酸經(jīng)乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）催化生成。乳酸的過量合成不僅會影響菌體生長，更能減弱L-谷氨酸合成的代謝流量、增加碳架的浪費，從而減少L-谷氨酸的產(chǎn)量及其轉(zhuǎn)化率并增加生產(chǎn)成本[5-6]。隨著基因組測序技術(shù)突飛猛進的發(fā)展以及谷氨酸棒桿菌基因操作技術(shù)的不斷完善，多株谷氨酸棒桿菌基因組測序工作已經(jīng)完成，使得通過分子生物學(xué)手段對該菌進行定向改造成為現(xiàn)實[7-8]。

本研究針對發(fā)酵過程中乳酸產(chǎn)量偏高的問題，以L-谷氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）TCCC11822為出發(fā)菌株，采用同源重組技術(shù)敲除其乳酸脫氫酶編碼基因ldhA，以期達到減少副產(chǎn)物、提高L-谷氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）TCCC 11822、大腸桿菌DH5α以及質(zhì)粒pK18mobsacB：天津科技大學(xué)代謝工程研究室。

1.1.2 主要試劑

T4DNA連接酶、ExTaqDNA聚合酶、EcoRⅠ、HindⅢ：日本TaKaRa公司；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒：北京博邁德科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂粉5g/L，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25g/L，玉米漿18mL/L，K2HPO42.2g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，尿素3g/L，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿20mL/L，葡萄糖30g/L，豆餅水解液10mL/L，MnSO4·H2O30mg/L，MgSO4·7H2O3g/L，K2HPO40.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg/L，VH300μg/L，VBl300μg/L，pH 7.0～7.2。

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0。

牛心浸液（beef heart infusion supplement，BHIS）培養(yǎng)基：牛腦心浸提物37g/L，山梨醇91g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

752紫外分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SBA-40C生物傳感儀：山東省科學(xué)院生物研究所；BIOTECH-10BGZ自動控制發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；Biometra 9700型PCR基因擴增儀：美國Syngene公司；NEPA21電轉(zhuǎn)儀：美國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 △ldh片段的擴增

根據(jù)Genbank中報道的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組中l(wèi)dhA上游717bp、下游600bp序列設(shè)計引物（見表1），以谷氨酸棒桿菌TCCC11822基因組DNA為模板、分別以L1和L2及L3和L4為引物，擴增出ldhA上、下游片段。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10min 1個循環(huán)；94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，25個循環(huán)；72℃延伸10min，1個循環(huán)。

然后再以L1和L4為引物、以上述PCR片段為模板，采用重疊PCR的方法擴增獲得△ldh片段。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10min 1個循環(huán)；94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s，25個循環(huán)；72℃延伸10min，1個循環(huán)。

表1 引物及其序列Table 1 Primers and its sequences

1.3.2 整合載體pK18mobsacB△ldh的構(gòu)建

將回收的重疊PCR產(chǎn)物△ldh經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII酶切后，采用T4 DNA連接酶連接至經(jīng)相同酶切的穿梭載體pK18mobsacB，然后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞并涂布于含卡那霉素（25μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上。提取陽性單克隆質(zhì)粒進行酶切驗證，將驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pK18mobsacB△ldh。

1.3.3 ldhA敲除菌株TCCC11822△ldh的構(gòu)建

將pK18mobsacB△ldh電轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌TCCC 11822感受態(tài)細胞中（電擊條件：25μF，12.5kV/cm，200Ω），于BHIS活化后涂布于含卡那霉素（25μg/mL）的BHIS固體培養(yǎng)基[9-11]。挑取陽性單克隆并提取其基因組DNA，采用引物Kana-N和Kana-C進行PCR驗證。

將驗證為陽性的菌株于含15g/L蔗糖的BHIS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后涂布于BHIS固體培養(yǎng)基，挑取單克隆并點接至含卡那霉素（25μg/mL）的BHIS固體培養(yǎng)基[12]。選取僅能在BHIS固體培養(yǎng)基中生長的單克隆并提取其基因組DNA，采用引物L(fēng)1和L4進行PCR驗證。將驗證正確的ldhA敲除菌株命名為TCCC11822△ldh。

1.3.4 菌體生物量的測定

取0.5mL發(fā)酵液，加入9.5mL去離子水，以去離子水為空白，采用752型分光光度計測定波長620nm處的吸光度值，菌體生物量以O(shè)D620nm值表示。

1.3.5 乳酸、L-谷氨酸及葡萄糖含量的測定

取經(jīng)10 000g離心5min后的發(fā)酵液上清，采用SBA-40C生物傳感儀測定乳酸、L-谷氨酸及葡萄糖含量。

1.3.6 比生長速率及轉(zhuǎn)化率的計算公式

比生長速率用每小時單位質(zhì)量的菌體所增加的菌體量表示，其計算公式如下：

式中：μ表示比生長速率，h-1；X表示菌體生物量（以O(shè)D620nm值表示）；t表示培養(yǎng)時間，h。

L-谷氨酸轉(zhuǎn)化率的計算公式如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 △ldh片段的構(gòu)建

以谷氨酸棒桿菌TCCC11822基因組為模板，L1、L2、L3和L4為引物進行重疊PCR，將產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，分別獲得與ldhA上、下游片段及△ldh片段分子質(zhì)量相近的片段，結(jié)果見圖1。由圖1可知，ldh上、下游PCR擴增片段大小分別為717bp和600bp左右，重疊PCR獲得大小約1 300bp左右的△ldh，電泳結(jié)果與預(yù)期大小一致，證明△ldh片段構(gòu)建成功。

圖1 △ldh片段的PCR構(gòu)建Fig.1 Construction of△ldhfragment by PCR

2.2 重組質(zhì)粒pK18mobsacB△ldh的構(gòu)建及鑒定

切膠回收△ldh的PCR擴增產(chǎn)物并采用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII酶切后，連接至經(jīng)相同酶切的穿梭載體pK18mobsacB，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB△ldh。提取重組質(zhì)粒分別采用EcoRⅠ及EcoRⅠ和HindⅢ酶切驗證，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，經(jīng)EcoRⅠ單酶切的重組質(zhì)粒電泳后出現(xiàn)一條分子質(zhì)量約為7 000bp的條帶，與預(yù)期一致。經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切的重組質(zhì)粒電泳后獲得分子質(zhì)量約為5 694bp和1 317bp的片段，分別與pK18mobsacB及△ldh分子質(zhì)量一致，表明pK18mobsacB△ldh已構(gòu)建成功。

2.3 ldhA敲除菌株TCCC11822△ldh的構(gòu)建及驗證

pK18mobsacB為谷氨酸棒桿菌基因敲除的常用質(zhì)粒。pK18mobsacB△ldh被轉(zhuǎn)化至TCCC11822后，因具有l(wèi)dhA同源序列而整合至該菌的基因組DNA中l(wèi)dhA上游或下游并隨染色體復(fù)制，從而使得宿主具有卡那霉素抗性。篩選具有卡那霉素抗性的克隆并提取其基因組DNA并采用引物Kana-N和Kana-C進行PCR驗證，經(jīng)電泳獲得一條分子質(zhì)量約為800bp的片段，與預(yù)期分子質(zhì)量一致，表明pK18mobsacB△ldh成功整合至TCCC11822。

圖2 重組質(zhì)粒pK18mobsacB△ldh的酶切鑒定Fig.2 Enzyme digestion of recombinant plasmid pK18mobsacB△ldh

pK18mobsacB△ldh中的sacB基因編碼分泌型蔗糖果聚糖酶，該酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖并將果糖聚合成高分子質(zhì)量的果聚糖，后者因具有毒性而造成細胞死亡。將上述重組菌接種至含蔗糖的BHIS液體培養(yǎng)基中，pK18mobsacB△ldh因同時具有l(wèi)dhA上游和下游同源序列而發(fā)生第二次重組，從而使得pK18mobsacB脫離染色體并使重組菌株喪失卡那霉素抗性，而未發(fā)生第二次重組的菌株會因過量果聚糖積累而死亡。篩選僅能在無抗性的BHIS固體培養(yǎng)基中生長的單克隆并提取其基因組DNA，采用引物L(fēng)1和L4進行PCR驗證，經(jīng)電泳獲得分子質(zhì)量為約1 300bp的片段（△ldh），而從出發(fā)菌株TCCC11822基因DNA中擴增出分子質(zhì)量為約2 200bp的片段，結(jié)果見圖3。圖3結(jié)果表明，ldhA基因敲除菌株TCCC11822△ldh成功構(gòu)建。

圖3 ldhA基因敲除菌株的PCR驗證Fig.3 Identification of deletionldhAby PCR

2.4 ldhA的敲除對L-谷氨酸搖瓶發(fā)酵的影響

為了研究ldhA基因敲除對L-谷氨酸發(fā)酵的影響，分別對TCCC11822和TCCC11822△ldh進行搖瓶分批發(fā)酵。發(fā)酵過程中定時取樣測定菌體生物量并計算其比生長速率，于發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中L-谷氨酸、乳酸及葡萄糖含量并計算轉(zhuǎn)化率。TCCC11822和TCCC11822△ldh生長曲線見圖4，L-谷氨酸、乳酸含量及轉(zhuǎn)化率結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，TCCC11822△ldh的L-谷氨酸產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率分別比TCCC 11822提高7.6%和5.5%，其乳酸產(chǎn)量較TCCC11822降低85.6%，但生物量略有下降。

圖4 TCCC11822和TCCC11822△ldh生長曲線Fig.4 Growth curves of TCCC11822 and TCCC11822△ldhin fermentation process

圖5 TCCC11822和TCCC11822△ldh L-谷氨酸產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率及乳酸合成量Fig.5L-glutamate production,convert ratio and lactate synthetic quantity by TCCC11822 and TCCC11822△ldh

乳酸是谷氨酸發(fā)酵過程中的常見副產(chǎn)物，由乳酸脫氫酶催化丙酮酸生產(chǎn)。過量的乳酸不僅影響菌體生物量，還會引起碳代謝流的浪費，降低L-谷氨酸產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率[13-15]。許多生物均具有多個乳酸脫氫酶同工酶，但經(jīng)檢索谷氨酸棒桿菌僅含一個乳酸脫氫酶編碼基因ldhA[8]。因此采用同源重組的方法敲除該基因。搖瓶實驗結(jié)果表明，該基因的敲除能有效降低乳酸生成量，從而使代謝流更多地流向三羧酸循環(huán)并顯著提高L-谷氨酸產(chǎn)量及其轉(zhuǎn)化率。本研究可為L-谷氨酸的菌種選育提供參考。

3 結(jié)論

本研究采用基因重組技術(shù)成功敲除了L-谷氨酸生產(chǎn)菌TCCC11822乳酸脫氫酶ldhA基因，敲除菌株的L-谷氨酸及其轉(zhuǎn)化率均明顯提高且乳酸合成量顯著降低，但其生物量略有下降。

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Impact ofldhAknockout onL-glutamate fermentation byCorynebacterium glutamicumTCCC11822

ZHANG Chenglin1,2,3,LI ZhiHua1,LIANG Jingbo1,2,3,XU Qingyang1,2,3*
(1.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology,Tianjin 300457,China; 2.Tianjin Engineering Laboratory of Efficient and Green Amino Acid Manufacture,Tianjin 300457,China; 3.College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Lactic acid is one of main by products excreted in to the fermentation medium byCorynebacterium glutamicum.To improveL-glutamate production and reduceL-lactate accumulation,pK18mobsacB△ldh used for dehydrogenase-encoding geneldhAknockout was constructed andldhA was knocked out fromL-glutamate producing strainCorynebacterium glutamicumTCCC11822,designated TCCC11822△ldh.Result showed that the lactate synthetic quantity reduced 85.6%,but the production and conversion ofL-glutamate increased 7.6%and 5.5%,respectively.The biomass declined slightly.This study will lay theoretical foundation on rational reconstruction ofL-glutamate and other amino acids producing strains.

L-glutamate;lactic acid;lactate dehydrogenase;gene knockout

Q78；TQ920.1

A

0254-5071（2014）04-0106-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.026

2014-01-10

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863計劃”（No.2013AA102106）

張成林（1982-），男，講師，博士，研究方向為代謝控制發(fā)酵。李志華（1974-），男，工程師，博士，研究方向為代謝控制發(fā)酵。注：以上兩人為并列第一作者。

*通訊作者：徐慶陽（1980-），男，副研究員，博士，研究方向為發(fā)酵工程。