枯草芽孢桿菌GXA-28發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸動力學研究

王青龍，陳桂光，曾偉，鄭雙鳳，唐真，粱智群

（廣西大學生命科學與技術(shù)學院，廣西南寧530004）

枯草芽孢桿菌GXA-28發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸動力學研究

王青龍，陳桂光，曾偉，鄭雙鳳，唐真，粱智群*

（廣西大學生命科學與技術(shù)學院，廣西南寧530004）

對耐熱高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌GXA-28分批發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的動力學特征進行了研究，基于菌體生長特性，結(jié)合Logistic方程和Luedeking-Piret方程，提出了菌體生長、產(chǎn)物合成、葡萄糖消耗以及谷氨酸鈉消耗的動力學模型。應(yīng)用Origin8.5對數(shù)據(jù)進行分析處理，得到了Bacillis subtilisGXA-28分批發(fā)酵合成γ-聚谷氨酸相應(yīng)的動力學參數(shù)。將模型預(yù)測值和實驗值進行比較，結(jié)果表明，模型基本反映了枯草芽孢桿菌GXA-28分批發(fā)酵過程中的動力學特征。

枯草芽孢桿菌GXA-28；γ-聚谷氨酸；動力學模型

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）主要是自然界中微生物來源的一種強水溶性的多聚氨基酸高分子化合物[1]。其具有良好的生物可降解性、可食用性、生物相容性和保濕性[2]，對人體和環(huán)境無毒無公害，可廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、環(huán)境保護等[3]，還可應(yīng)用于化妝品、食品用水凝膠[4]、黏稠劑[5]、土壤沙地的蓄水保水劑[6]、高吸水劑[7-8]、高強度纖維的制備以及生物醫(yī)學等領(lǐng)域[9]。近年來，隨著國內(nèi)外對γ-聚谷氨酸研究的深入，γ-聚谷氨酸作為一種可降解高分子化合物，越來越顯現(xiàn)出其廣闊的科研價值和應(yīng)用前景。目前由于受到發(fā)酵工藝、生產(chǎn)成本及生產(chǎn)菌株的限制，國內(nèi)尚未見大規(guī)模生產(chǎn)的相關(guān)報道，因此對聚谷氨酸發(fā)酵過程的研究就有了很重要的現(xiàn)實意義。

國內(nèi)目前主要是將菌種選育以及對發(fā)酵條件的優(yōu)化作為研究重點，有關(guān)發(fā)酵動力學模型的報道相對較少[10]。本實驗考察了γ-PGA分批發(fā)酵過程中的菌體生長、產(chǎn)物合成、底物消耗情況。運用Origin 8.5數(shù)據(jù)處理軟件對枯草芽孢桿菌GXA-28發(fā)酵動力學模型進行非線性擬合，并獲得了相應(yīng)的動力學模型及模型參數(shù)。利用擬合方程可以預(yù)測分批發(fā)酵過程中菌體量、γ-PGA量、葡萄糖量、谷氨酸鈉量的變化情況，為下一步的放大培養(yǎng)及補料分批發(fā)酵等提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌GXA-28（B.subtilisGXA-28）：生命科學與技術(shù)學院自主篩選，菌株保藏編號CCTCC M2012347。

葡萄糖：天津市科密歐化學試劑有限公司；谷氨酸鈉（純度≥99%）：南寧市荷花味精有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；KH2PO4：天津市紅巖化學試劑廠；MgSO4：天津博迪化工股份有限公司。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、谷氨酸鈉5g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO40.1g/L，pH 6.5±0.1。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L、酵母膏2.5g/L、谷氨酸鈉20g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO40.1g/L，pH 6.5±0.1。

1.2 儀器與設(shè)備

YP1200型電子天平：上海精科實業(yè)有限公司；HVE-50自動滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；SPX-250型生化培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療儀器廠；EBA21型高速離心機：德祥科技有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；UV-1800紫外分光光度計：日本SHIMADIU公司；SKY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海蘇坤實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)液的制備

取一管甘油保藏菌種接入裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于42℃、160r/min條件下培養(yǎng)16h，得到種子培養(yǎng)液。

1.3.2 分批發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)得到的種子培養(yǎng)液取1mL接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于42℃、160r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)?？疾觳煌瑫r間段培養(yǎng)液中的菌體生長、產(chǎn)物合成、底物消耗情況。

1.3.3 殘?zhí)?、殘谷氨酸鈉含量測定

由上述培養(yǎng)條件獲得的發(fā)酵液采用生物傳感分析儀測定性能指標，溫度10～35℃，相對濕度＜90%，可同時測定β-D-葡萄糖、L-谷氨酸含量，測定范圍：0～100mg/100mL。

1.3.4 聚γ-谷氨酸產(chǎn)量的測定

按照參考文獻[11]的方法測定。

1.3.5 枯草芽孢桿菌GXA-28生物量的測定

發(fā)酵液稀釋10倍后，用可見分光光度計于波長660nm處測定其吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 動力學模型的建立

2.1.1 菌體生長動力學模型的建立

描述菌體生長的動力學模型最常用的有Monod方程和Logistic方程，Monod方程主要用來描述理想化的均衡生長動力學模型。Logistic方程[12]與Monod方程相比，其限制因子主要是菌體濃度或生長空間，而γ-PGA分批發(fā)酵過程后期發(fā)酵液黏度較大，因此菌體生長將受到生長空間及氧傳質(zhì)等因素的限制，選用Monod方程進行建模會導(dǎo)致結(jié)果有較大偏差，因此本實驗選用Logistic方程對菌體生長規(guī)律進行描述。Logistic方程為：

式中：X為菌體生物量（用OD660nm值表示）；μm為最大比生長速率，h-1；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）。

將上式對時間t積分，得到Logistic方程的積分形式

式中：X0為菌體初始生物量（用OD660nm值表示）；μm為最大比生長速率，h-1；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）；t為時間，h。

2.1.2 產(chǎn)物合成動力學模型建立

通過跟蹤取樣分析發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌GXA-28分批發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA分為2個階段：第一個階段主要是菌體快速的生長，產(chǎn)物合成量較少，此時基質(zhì)的消耗主要用于菌體的生長；第二階段時γ-PGA開始快速合成，在此過程中菌體量已經(jīng)接近穩(wěn)定值，此時基質(zhì)的消耗主要用于γ-PGA的合成。由此可以明顯看出，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA屬于部分偶聯(lián)型[13]。因此本實驗選用由Luedeking和Piret提出的Luedeking-Piret方程對γ-PGA的合成規(guī)律進行描述如下：

將上式簡化得

式中：α，β為動力學模型參數(shù)；X為菌體生物量（用OD660nm值表示）；μm為最大比生長速率，h-1；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）；dP/dt為γ-聚谷氨酸產(chǎn)物合成速率，g（/L·h）。

將上式積分得

式中：P為γ-聚谷氨酸產(chǎn)量，g/L；α，β為動力學模型參數(shù)；X0為菌體初始生物量（用OD660nm值表示）；μm為最大比生長速率，h-1；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）；t為時間，h。

2.1.3 葡萄糖消耗動力學模型的建立

葡萄糖在聚谷氨酸發(fā)酵過程中是細胞生長和產(chǎn)物合成所需的重要營養(yǎng)成分，其消耗主要用于3個方面：①生成新的細胞；②用來維持細胞基本生命活動；③是γ-PGA的合成。因此葡萄糖消耗動力學可以用如下方程描述

式中：YX/S為葡萄糖用于菌體生長的得率常數(shù)，g/g；YP/S為葡萄糖用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)，g/g；mx為微生物的維持常數(shù)，g/（L·h）；X為菌體生物量（用OD660nm值表示）；dS1/dt為葡萄糖消耗速率，g/（L·h）。

在分批發(fā)酵過程中，菌體呼吸消耗的基質(zhì)可以認為是菌體生長消耗的一部分[14-15]，因此葡萄糖的消耗就可以簡單的分為菌體生長的消耗和產(chǎn)物合成的消耗兩部分。故葡萄糖消耗的動力學模型可以簡化為

式中：k1為葡萄糖用于菌體生長的得率常數(shù)，g/g；k2為葡萄糖用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)，g/g。將（1）、（3）式子帶入得

式中：k1為葡萄糖用于菌體生長的得率常數(shù)，g/g；k2為葡萄糖

用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)，g/g；X為菌體生物量（用OD660nm值表示）；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）；α，β為動力學模型參數(shù)；μm為最大比生長速率，h-1。

將（8）式子積分得

式中：S1為葡萄糖的質(zhì)量濃度，g/L；S0為葡萄糖初始質(zhì)量濃度，g/L；X0為菌體初始生物量（用OD660nm值表示）；k1為葡萄糖用于菌體生長的得率常數(shù)，g/g；k2為葡萄糖用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)，g/g；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）；α，β為動力學模型參數(shù)；μm為最大比生長速率，h-1。

2.1.4 谷氨酸鈉消耗動力學模型的建立

枯草芽孢桿菌GXA-28屬于底物依賴型菌株，因此谷氨酸納的消耗主要用于γ-PGA的合成，谷氨酸鈉消耗的動力學模型可以簡化為：

式中：dS2/dt為谷氨酸鈉消耗速率，g/（L·h）；k3為谷氨酸鈉用于產(chǎn)物合成的得率常數(shù)，g/g。

對上式積分得

式中：S2為谷氨酸鈉質(zhì)量濃度，g/L；S0為葡萄糖初始質(zhì)量濃度，g/L；X0為菌體初始生物量（用OD660nm值表示）；k3為谷氨酸鈉用于產(chǎn)物合成的得率常數(shù)，g/g；Xmax為菌體最大生物量（用OD660nm值表示）；α為動力學模型參數(shù)；μm為最大比生長速率，h-1。

2.2 動力學模型參數(shù)求解

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)和上述的模型方程應(yīng)用Origin 8.5軟件對實驗值進行非線性擬合，獲得最優(yōu)化參數(shù)估計值。并得出實驗值與預(yù)測值之間的方差，分別為菌體生長動力學模型R2=0.997，產(chǎn)物合成動力學模型R2=0.993，葡萄糖消耗動力學模型R2=0.991，底物谷氨酸鈉模型R2=0.989。參數(shù)估計值結(jié)果見表1。

表1 分批發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的動力學參數(shù)估計值Table 1 Estimated kinetic parameter of γ-PGA batch fermentation

將擬合所得模型參數(shù)代入方程可以得出γ-PGA分批發(fā)酵的動力學模型分別為：

菌體生長的動力學模型

產(chǎn)物γ-PGA合成的動力學模型

葡萄糖消耗的動力學模型

谷氨酸鈉消耗的動力學模型

2.3 曲線擬合分析

為了驗證上述動力學模型的可靠性，本實驗運用Origin 8.5數(shù)據(jù)處理軟件對γ-PGA分批發(fā)酵過程進行非線性擬合分析，得到了γ-PGA分批發(fā)酵過程中菌體生長、產(chǎn)物合成、葡萄糖消耗以及谷氨酸鈉消耗的擬合曲線分別如圖1～圖4所示。從圖1～圖4可以看出，除了在發(fā)酵開始階段和結(jié)束階段的個別點的相對誤差較大外，在發(fā)酵中期，所建動力學模型都能對真實的發(fā)酵情況進行很好的擬合?？梢哉J為擬合曲線基本反映了γ-PGA真實的發(fā)酵過程。

圖1 菌體生物量實驗值與擬合曲線的比較Fig.1 Comparison of fitted curve and measured biomass

圖2 γ-PGA產(chǎn)量實驗值與擬合曲線的比較Fig.2 Comparison of fitted curve and measured γ-PGA yield

圖3 剩余葡萄糖量實驗值與擬合曲線比較Fig.3 Comparison of fitted curve and measured remaining glucose content

圖4 谷氨酸鈉剩余量實驗值與擬合曲線比較Fig.4 Comparison of fitted curve and measured sodium glutamate content

3 結(jié)論

通過對枯草芽孢桿菌GXA-28發(fā)酵合成γ-PGA特征分析，運用Origin 8.5數(shù)據(jù)處理軟件進行非線性擬合，得出其分批發(fā)酵過程中菌體生長、γ-PGA合成、葡萄糖消耗、底物消耗的動力學模型及相關(guān)參數(shù)，通過擬合曲線圖可以看出，實驗值與模型曲線非常接近。將預(yù)測值與實驗值進行對比可以看出，除發(fā)酵初期和發(fā)酵末期的個別點相對誤差較大外，在發(fā)酵中期動力學模型能很好的對實驗數(shù)據(jù)進行擬合。因此可以用該模型來預(yù)測發(fā)酵液中菌體量、產(chǎn)物合成量、葡萄糖以及谷氨酸鈉在發(fā)酵過程的變化情況，為以后工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)及補料分批發(fā)酵提供參考。

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Fermentation kinetics model of γ-polyglutamic acid production byBacillis subtilisGXA-28

WANG Qinglong,CHEN Guiguang,ZENG Wei,ZHENG Shuangfeng,TANG Zhen,LIANG Zhiqun*
(College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning 530004,China)

The kinetics feature of a heat-resistant and high-yieldγ-polyglutamic acid strainBacillis subtilisGXA-28 was investigated.Based on bacterial growth characteristics,combining with Logistic and Luedeking-Piret equation,the kinetic model of microbial growth,γ-polyglutamic acid formation and glucose consumption during fermentation were proposed.The data was analyzed with origin 8.5 to generate the kinetics parameters ofγ-ploy glutamic acid production byB.subtilisGXA-28 batch fermentation.The prediction value was compared with the experimental value;it showed that the model could provide reasonable description for the batch fermentation process ofB.subtilisGXA-28.

Bacillis subtilisGXA-28;γ-polyglutamic acid;kinetics model

Q936

A

0254-5071（2014）04-0075-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.018

2014-03-13

廣西研究生教育創(chuàng)新計劃資助項目（YCBZ2012004）；2013年廣西大學亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室研究課題；2013年廣西大學微生物及植物遺傳工程教育部重點實驗室主任基金課題

王青龍（1988-），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程及生物制藥。

*通訊作者：梁智群（1959-），男，教授，博士，研究方向為生物工程學。