沒(méi)食子對(duì)口腔細(xì)菌生物膜中細(xì)菌代謝的作用研究

馮錦虹， 李新尚， 牛巧麗， 趙 今

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心， 新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所， 烏魯木齊 830054)

現(xiàn)代齲病病因?qū)W認(rèn)為,牙菌斑是典型的生物膜結(jié)構(gòu),是齲病發(fā)生的始動(dòng)因子。口腔中牙菌斑生物膜是由多種微生物在牙面上沉積的有機(jī)基質(zhì)中互相集聚、交聯(lián)而形成的生態(tài)結(jié)構(gòu)，生物膜中各微生物相互依存，相互競(jìng)爭(zhēng)，構(gòu)成了復(fù)雜的生態(tài)關(guān)系。糖代謝是細(xì)菌致齲的重要環(huán)節(jié)，是齲病發(fā)生的毒力因素之一。蔗糖是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)唯一的底物，GTF對(duì)蔗糖具有高度特異性，只能催化蔗糖的葡糖基部分，以一定形式的糖苷鍵相連而成為葡聚糖，對(duì)葡萄糖或其他雙糖或多糖的葡糖基沒(méi)有催化聚合作用。GTF是非水溶性葡聚糖產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，因此需要研究藥物對(duì) GTF活性的影響，才能說(shuō)明藥物對(duì)細(xì)菌生物膜代謝的作用機(jī)制。本研究通過(guò)觀察沒(méi)食子鞣質(zhì)及其有效提取物作用下細(xì)菌生物膜中GTF的變化，了解 沒(méi)食子鞣質(zhì)及其有效提取物對(duì)口腔細(xì)菌生物膜中GTF活性的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株變形鏈球菌 (Streptococcus mutans ATCC 25175)、血鏈球菌 (Streptococcus sanguis ATCC 10556)、 粘性放線菌 (Actinomyces viscosus ATCC 19246)、乳酸桿菌 (Lactobacillus rhamnosus AC 4130)由口腔生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2菌懸液的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件溫度：37℃由循環(huán)水浴箱維持； 攪拌：低速，由磁力攪拌器控制，以使發(fā)酵罐中菌懸液混勻； 厭氧環(huán)境：95% N2，5% CO2，流速10 mL/min，由蠕動(dòng)泵控制； pH：用0.1 M NaOH溶液維持在7.0左右，由pH控制儀與蠕動(dòng)泵調(diào)節(jié)； 清除率：D=0.1/h，由蠕動(dòng)泵控制。4種實(shí)驗(yàn)菌株在體外培養(yǎng)及鑒定:將配制濃度為1.0 MFarland的4種實(shí)驗(yàn)菌菌懸液、BHI培養(yǎng)基、粘性放線菌和乳桿菌的菌懸液加入發(fā)酵罐中連續(xù)培養(yǎng)2 d，加入變形鏈球菌和血鏈球菌的菌懸液培養(yǎng)2～3 d，當(dāng)發(fā)酵罐中的混合菌培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定之后用蠕動(dòng)泵將混合菌懸液泵出，比濁調(diào)整菌懸液濃度為1.0 MFarland使用。

1.3沒(méi)食子和有效提取物藥液的制備及實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)藥物為沒(méi)食子鞣質(zhì)和有效提取物(沒(méi)食子酸+沒(méi)食子酸甲酯)，藥物及藥物濃度的選擇根據(jù)藥物對(duì)口腔細(xì)菌的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定[1-2]，沒(méi)食子鞣質(zhì)和有效提取物(沒(méi)食子酸+沒(méi)食子酸甲酯)為4 mg/mL。先用蒸餾水將藥物配制成64 mg/mL的母藥液放置冰箱(4℃)備用。使用時(shí)將母藥液按2倍稀釋法溶于BHI液體培養(yǎng)基中形成BHI藥液培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(空白組)，陽(yáng)性對(duì)照組(為沒(méi)有干預(yù)處理形成的細(xì)菌生物膜)、沒(méi)食子鞣質(zhì)組和有效提取物(沒(méi)食子酸+沒(méi)食子酸甲酯)組。 每組6個(gè)平行樣本。

1.4試劑與儀器YZ1515型單通道蠕動(dòng)泵(保定蘭格恒流泵有限公司)，pH控制儀(Jenco，上海任氏電子有限公司)，HX-1050型循環(huán)水浴箱(北京博醫(yī)康技術(shù)公司)， 培養(yǎng)罐(continuous culture vessel，四川大學(xué)玻璃儀器制造廠)，CJJ-781型磁力加熱攪拌器(江蘇金壇振興儀器廠)，恒溫培養(yǎng)箱(上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠)，標(biāo)準(zhǔn)24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning Incorporated)， CrystalTMSpecTM比濁儀(美國(guó) Becton Dickinson and Company)，HTS 7000 PLUS型多孔板(熒光/紫外光)高效分析儀(美國(guó)PERKIN ELMER)，超濾離心管(NanosepR Device OD030C33 Pall Life Sciences U.S.)，標(biāo)準(zhǔn)96孔微量板(Corning Incorporated CostorR3599 )。 固體硫酸銨，0.01 mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液，0.24 mol/L HCl，0.2 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液。溶液A：純酒石酸鈉12 g，無(wú)水碳酸鈉24 g，加水250 mL，混勻后緩慢加入10%硫酸銅溶液40 mL和碳酸氫鈉16 g。500 mL熱蒸餾水加入無(wú)水硫酸銨180 g，煮沸去除氣體后冷卻。2種液體混合定容至1.0 L。溶液B(鈉爾遜顯色劑)：鉬酸鈉25 g溶于450 mL蒸餾水，緩慢加入濃硫酸21 mL。3 g砷酸氫二鈉溶到25 mL蒸餾水中，再緩慢注入上述溶液中，完全混合，37℃放置24～48 h，溶液變黃后移至棕色瓶保存。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：100 mg/L。

1.5粗酶提取液的制備用于細(xì)胞培養(yǎng)直徑15 mm無(wú)菌蓋玻片放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每孔加入菌懸液500 μL、BHI培養(yǎng)基1 500 μL、80% N2、20% CO2，37℃下厭氧培養(yǎng)12 h時(shí)更換1 500 μL新鮮培養(yǎng)基，形成24 h細(xì)菌生物膜，去除孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗孔及玻片2次去除表面浮游細(xì)菌，加入藥液培養(yǎng)基(2 000 μL/孔)。對(duì)照組加入BHI 液體培養(yǎng)基，每組6個(gè)平行樣，80% N2、20% CO2，37℃下厭氧培養(yǎng)18～20 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基放入離心管內(nèi)，PBS緩沖液1 000 μL/孔洗孔2次，與離心管內(nèi)液體和并，3 000 r/min 離心30 min，上清液中加入固體硫酸銨達(dá)60%飽和度，放入4℃冰箱24 h，15 000 r/min離心30 min ，棄去上清液，將沉淀物用5 mL含0.01%NaN3的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解，放入超濾離心管內(nèi)，10 000 r/min 離心15 min，棄去管底水，濾膜上的沉淀用相同緩沖液溶解后再離心5～10 min，收集濾膜管內(nèi)粗酶提取液進(jìn)行酶活性測(cè)定。重復(fù)2次實(shí)驗(yàn)。

1.6各組酶活性的測(cè)定(1)酶底物反應(yīng)：排管6支，每支管內(nèi)加入粗酶提取物200 μL，取0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)1 mL、0.5 mol/L蔗糖1 mL、雙蒸水4 mL混勻，在所有管加入三合一試劑300 μL，37℃(200 r/min)孵育1 h，加入0.24 mol/L HCl(50 μL/管)終止反應(yīng)，加入雙蒸水1 250 μL混勻，3 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定還原糖。(2)用標(biāo)準(zhǔn)96孔微量板，熒光(485/535)進(jìn)行板掃描，確定孔板的中心位置，在HTS700Plus上編制檢測(cè)程序：波長(zhǎng)為635 nm，每孔讀取4個(gè)點(diǎn)的均值，做盤圖設(shè)計(jì)。(3)測(cè)定還原糖：排管2組，用12通道加樣槍及配套加樣頭，按盤圖位置，分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線管加入0、50、100、150、200 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 mg/mL),雙蒸水250、200、150、100、50、0 μL補(bǔ)足。上清液樣本250 μL。在所有管中加入A溶液250 μL，搖勻，沸水煮浴20 min，冰水冷卻后每管加入B溶液250 μL，加入雙蒸水2 mL，搖勻。(4)用12通道加樣槍及配套加樣頭，吸取糖測(cè)定液300 μL加入96孔微量板相應(yīng)孔中，按所編制檢測(cè)程序在HTS700Plus上測(cè)量。HTS700Plus自動(dòng)用635 nm波長(zhǎng)讀數(shù)，并自動(dòng)換算出樣本GTF還原糖含量。(5)將含量導(dǎo)入Excel，用每個(gè)樣本除以該樣本的蛋白含量即得到該樣本每 mg 胞外GTF蛋白所還原的糖含量。GTF活力計(jì)算：還原葡萄糖量/198.17(葡萄糖分子量)/60。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件包對(duì)GTF活性進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)酶活性抑制率進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

空白組、陽(yáng)性對(duì)照組、沒(méi)食子鞣質(zhì)組及有效提取物組24 h細(xì)菌生物膜GTF 的活性分別為(0.003 2±0.022)、(0.660 1±0.204)、(0.018 6±0.077)、(0.052 7±0.035)。口腔細(xì)菌組成的24 h的細(xì)菌生物膜經(jīng)沒(méi)食子鞣質(zhì)和有效提取物所選定的實(shí)驗(yàn)濃度作用后，沒(méi)食子鞣質(zhì)組GTF活性為(0.018 6±0.077)，有效提取物組GTF 活性為(0.052 7±0.035)，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組GTF的活性受到明顯抑制，與陽(yáng)性對(duì)照組GTF活性相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

齲病是人類最常見(jiàn)的口腔疾病，發(fā)病率高，嚴(yán)重影響人類的口腔健康和全身健康。牙菌斑生物膜是口腔細(xì)菌致病的重要微生態(tài)環(huán)境，生物膜中各微生物相互依存，相互競(jìng)爭(zhēng)，構(gòu)成了復(fù)雜的生態(tài)關(guān)系。大量的研究表明生物膜中細(xì)菌的抗藥性及各種生化代謝效率均顯著高于體外培養(yǎng)游離細(xì)菌[3-4]。生物膜對(duì)宿主防御系統(tǒng)有較強(qiáng)的抵抗力，耐受性強(qiáng)，對(duì)抗生素敏感性下降，具有空間和環(huán)境的多樣性、能表達(dá)不同于浮游細(xì)菌的表型、抵抗水流的沖刷等特點(diǎn)。因此，關(guān)于藥物對(duì)細(xì)菌生物膜相關(guān)疾病的研究需要從藥物對(duì)細(xì)菌生物膜的形成、生物膜細(xì)菌組成與代謝、生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物膜的胞外基質(zhì)的影響等方面進(jìn)行深入研究，才能闡明藥物對(duì)生物膜的作用機(jī)制。

牙菌斑生物膜內(nèi)部存在著復(fù)雜的代謝活動(dòng)，其中糖代謝是細(xì)菌致齲的重要環(huán)節(jié)，非水溶性葡聚糖的產(chǎn)生在形成生物膜過(guò)程中起著重要作用[5]。參與菌斑基質(zhì)的組成，促進(jìn)細(xì)菌的粘附、聚集，加速菌斑的形成。水不溶性胞外多糖還具有生物屏障作用，使菌斑內(nèi)外各種物質(zhì)的出入受到限制；使菌斑內(nèi)細(xì)菌代謝產(chǎn)物如有機(jī)酸等不易擴(kuò)散，造成釉質(zhì)表面局部pH值下降，是齲病發(fā)生的毒力因素之一。GTF對(duì)蔗糖具有高度特異性，GTF在分子結(jié)構(gòu)上可大致分為2個(gè)相對(duì)獨(dú)立的功能區(qū)：1個(gè)是位于氨基端約2/3肽段的催化區(qū)，結(jié)合并裂解蔗糖；1個(gè)是位于羧基端約1/3肽段的葡聚糖結(jié)合區(qū)，提供結(jié)合葡聚糖的受體。GTF催化蔗糖合成葡聚糖分為2個(gè)連續(xù)的過(guò)程：蔗糖水解成果糖和葡萄糖，將葡糖基轉(zhuǎn)移到多糖鏈上合成葡聚糖，其活性決定細(xì)菌代謝終產(chǎn)物的生成，因此通過(guò)抑制GTF的活性能抑制牙菌斑基質(zhì)的形成，從而達(dá)到防齲的目的。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出經(jīng)沒(méi)食子鞣質(zhì)及其有效提取物所選定的實(shí)驗(yàn)濃度作用后，口腔細(xì)菌組成的24 h細(xì)菌生物膜GTF的活性受到明顯抑制，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鞣質(zhì)具有強(qiáng)烈的抑制變形鏈球菌GTF的作用，其中具有5～6個(gè)倍?；膒enta galloyl glucose(黃倍酰單寧)和hexagalloyl glucose，在1 mmol/L濃度即顯示出了近100% 的抑制活性，甚至強(qiáng)于洗必泰[6]。對(duì)植物多酚的研究也證實(shí)，隨著聚合程度的增加，烏龍茶中多酚類物質(zhì)對(duì)變形鏈球菌的GTF的抑制活性增加[7]。 吳永生等[8]研究發(fā)現(xiàn)五倍子多酚性化合物對(duì)GTF具有明顯的抑制作用。

有研究表明沒(méi)食子鞣質(zhì)對(duì)浮游狀態(tài)及生物膜狀態(tài)下的GTF酶活性抑制差異顯著[9]。目前對(duì)此差異的原因尚不清楚，可能是生物膜狀態(tài)的細(xì)菌啟動(dòng)了一套與浮游狀態(tài)不同的基因表達(dá)形式，從而GTFB、GTFC、GTFD 基因的表達(dá)發(fā)生改變，與藥物敏感性有直接關(guān)系。Koo等[10]報(bào)道顯示芹菜素可以抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，并能顯著降低GTFB 和GTFC 的表達(dá)，相反增加GTFD 的表達(dá)。本課題組后續(xù)研究還將在mRNA水平研究實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)口腔細(xì)菌生物膜狀態(tài)GTF基因表達(dá)的差異，進(jìn)一步探討天然藥物防齲的作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙今，李繼遙，周學(xué)東，等. 口腔多菌生物膜對(duì)防齲中藥敏感性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2006，24(6)：546-550.

[2] 趙今，朱昞，周學(xué)東，等. 五倍子不同組分對(duì)口腔細(xì)菌生物膜的清除效應(yīng)[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007，23(1)：23-27.

[3] Mayer C, Moritz R, Kirschnner C, et al. The role of intermolecular interactions:studies on model systems for bacterial biofilms [J]. Int J Biol Macromol, 1999, 26(1):3-16.

[4] Mark D, Fischer W, Krokotsch A, et al. The intercellular adhesin involved in biofilm accumulation of staphyloccus purification and structural analysis [J]. J Bacteriol, 1996, 178(1):175-183.

[5] 趙今，孫玉亮，牛巧麗，等.沒(méi)食子鞣質(zhì)及有效提取物對(duì)致齲細(xì)菌代謝的作用[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32(1)：3-6.

[6] Hsieh TJ, Liu TZ, Chia YC, et al. Protective effect of methyl gallate from Toona sinensis (Meliaceae) against hydrogen peroxide-induced oxidative stress and DNA damage in MDCK cells [J]. Food Chem Toxicol，2004, 42(5):843-850.

[7] Sasaki H, matsumot M, Tamaka T, et al. Antibacterial activity of polyphenol components in onlong tea extract against Streptococcus mutans[J]. Caries Res 2004, 38(1):2-8.

[8] 吳水生，施紅，張小如，等. 中藥復(fù)方藥效學(xué)研究中應(yīng)重視多靶點(diǎn)作用的意義[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，21(7)：545 - 546.

[9] 林靜，趙今，朱明，等. 沒(méi)食子鞣質(zhì)聯(lián)合氟化鈉對(duì)不同狀態(tài)變形鏈球菌葡萄糖及轉(zhuǎn)移酶活性的影響[J]. 中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，8(5)：264 - 267.

[10] Koo H, Xiao J, Klein MI, et al. Exopolysaccharides Produced by Streptococcus mutans Glucosyltransferases Modulate the Establishment of Microcolonies within Multispecies Biofilms[J]. J Bacteriol,2010,192(12):3024-3032.