心臟干細(xì)胞基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用回顧與展望

段茂林 綜述，廖 斌 審校

CSCs對(duì)心臟干細(xì)胞（CardiacStemCells，CSCs）的發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)對(duì)心臟是“終分化不可再生”器官的認(rèn)識(shí)。經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究，目前已經(jīng)對(duì)CSCs 有了初步的認(rèn)識(shí)，包括CSCs 的形態(tài)特征，遷移性，具有代表性的細(xì)胞標(biāo)記物，以及CSCs的分化潛能。心臟，從來都被認(rèn)為是一個(gè)終分化的器官，臨床上一些疾病，例如心肌梗死、心力衰竭、擴(kuò)張性心肌病、病竇綜合癥等造成的心肌損傷都是不可逆的，臨床治療中仍不能找到有效的方法“獲取”新的心肌來代替受損的心肌。2002年Hierlihy1等從小鼠心肌細(xì)胞中分離出一類具有干細(xì)胞生物行為特征的細(xì)胞，命名曰“邊緣細(xì)胞群”（SidePopulation,SP），這類細(xì)胞有向心肌細(xì)胞分化的潛能，證明了心臟并不是一個(gè)終分化的器官，心臟仍然具有再生能力。CSCs 越來越多的研究，不斷支持CSCs 存在于心臟的結(jié)論，并且證明了其具有自我增殖和分化成心臟各種細(xì)胞成分的潛能，CSCs 逐漸走進(jìn)了人們的視野，成為組織再生工程研究的熱點(diǎn)對(duì)象。

1 CSCs的分類

CSCs 被證明存在以來，就一直成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)對(duì)象。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到CSCs并非是一類單一特性的干細(xì)胞，而是一群處于不同分化階段、并具有向心臟各類細(xì)胞（心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等）分化潛能的譜系細(xì)胞群體2,3。CSCs位于心臟干細(xì)胞巢（CardiacStemCellsniches）中，處于多向分化程度，并通過結(jié)構(gòu)和功能蛋白與其周圍的支持細(xì)胞（surpportingcells）相連接2,3，因此，真正意義的CSCs應(yīng)該叫做心臟干細(xì)胞譜系（cardiacstem cellsculture）。通過尋找CSCs的特有細(xì)胞表面標(biāo)記物來區(qū)分它們，是目前最通用、最有效也是最具有可行性的方法。對(duì)于CSCs 的不斷研究使人們發(fā)現(xiàn)，很多存在于其他類型干細(xì)胞表面的標(biāo)記物也出現(xiàn)在CSCs 表面，因此借用這些細(xì)胞表面標(biāo)記物可以使CSCs得以初步篩分，但由于這一系列標(biāo)記物并非CSCs所特有，而且分離和純化CSCs也缺乏有效方法，這種方法對(duì)CSCs的分類是否有意義，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。目前，人們?cè)贑SCs 表面發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞標(biāo)記物有C-kit，MDR,Sca-1,Islt-1以及一些比較特殊的CSCs團(tuán)體結(jié)構(gòu)。

1.1 C-kit+CSCs C-kit，干細(xì)胞因子，在許多成體干細(xì)胞都有表達(dá)。C-kit 是目前研究得最徹底的CSCs標(biāo)記物。2003年，Antonio4等利用流式細(xì)胞儀首次從小鼠心臟中分離出了Lin-C-kit+細(xì)胞，證明了這類細(xì)胞具有克隆、自我更新以及多能分化潛能，也通過熒光染色的方法證明了這類細(xì)胞可以產(chǎn)生心臟結(jié)構(gòu)譜系標(biāo)記物，如GATA-4、Nkx-2.5、MEF2C，同時(shí)指出C-kit并不表達(dá)于造血細(xì)胞系；2010年，HeJQ5等指出，C-kit最先出現(xiàn)在造血譜系細(xì)胞，但在造血細(xì)胞分化時(shí)消失；2005年Konrad6等在對(duì)急性心肌梗死病人及慢性缺血性心臟病病人的研究中發(fā)現(xiàn)，在急性心肌梗死模型中，梗死區(qū)有一群“快速反應(yīng)”的CSCs，它們可以分化出心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，源于冠脈的干細(xì)胞可以分化出內(nèi)皮細(xì)胞，并且這些CSCs 中約60%是C-kit+-MDR+-Sca-1+譜系細(xì)胞，單純表達(dá)C-kit+的CSCs 占12%左右，而慢性缺血性心臟病CSCs 的生長卻很不明顯；近來的實(shí)驗(yàn)也已證明，體外已經(jīng)成功培養(yǎng)出可以穩(wěn)定表達(dá)C-kit 的人CSCs5。以上證據(jù)充分表明，如果可以在體外培養(yǎng)出這樣的干細(xì)胞、保持其分化增殖能力，并將其移植回心肌梗塞患者心臟內(nèi)，使其增殖分化出新的心肌細(xì)胞來替代受損的心肌，對(duì)于恢復(fù)患者心功能有可能會(huì)有效。

1.2 MDR+CSCs MDR（multi-drug resistance）多耐藥。在各種人體組織都有發(fā)現(xiàn)，其特點(diǎn)是能夠排出代謝性標(biāo)記物如煙酸己可堿333427，這個(gè)特性需要依賴P-糖蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，如ABCG28,而P-糖蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則是MDR 基因編碼產(chǎn)生9。MDR+CSCs是一種特殊類型的CSCs，有實(shí)驗(yàn)1,10在成人心肌中分離出了側(cè)群細(xì)胞（side populationcell，SPcell），并且證明了這類細(xì)胞可以表達(dá)MDR 基因，產(chǎn)生ABCG2,而Oyama10 的實(shí)驗(yàn)證明，表達(dá)ABCG2 的SP細(xì)胞在心肌中可以分化出心肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等，這也證明了SP細(xì)胞具有再生能力，但是SP細(xì)胞在心臟中含量很低，其對(duì)心肌的修復(fù)能力效果還有待研究。

1.3 Sca-1+CSCs Sca-1 干細(xì)胞抗原1，屬于Ly-6 家族成員之一，最早是以造血干細(xì)胞譜系表面抗原被報(bào)道11，2004 年Matsuura12 等通過磁珠分離法從成年鼠心臟中分離出Sca-1+CSCs，它們?nèi)狈υ煅?xì)胞系干細(xì)胞的表面特征標(biāo)記物，他們將分離出的Sca-1+CSCs于體外培養(yǎng)，催產(chǎn)素刺激2 周后，培養(yǎng)出可搏動(dòng)心肌細(xì)胞，并檢測到這些細(xì)胞可以表達(dá)一系列產(chǎn)生心肌結(jié)構(gòu)蛋白的基因，比如GATA-4，MEF2C等；2012年，Ye-JQ13 等在急性心肌梗死小鼠動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，急性心梗后2 周，梗死區(qū)產(chǎn)生了許多具有干細(xì)胞行為特性的細(xì)胞，多為Sca-1+-CD45-亞群細(xì)胞，這些細(xì)胞可以分化成成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，并且證明了這些細(xì)胞是心源性細(xì)胞，而非源自骨髓干細(xì)胞。

1.4 Islt-1+CSCs Islt 胰島因子，在胚胎和出生后的胎兒，我們都能發(fā)現(xiàn)Islt-1+CSCs 的存在，并且相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，Islt-1+CSC 似乎對(duì)于心臟及大血管的正常發(fā)育有重要作用。2003年L.C Chen14等描述了關(guān)于Islt-1+CSCs的特征和其對(duì)心臟發(fā)育的重要性，他們指出Islt-1+CSCs源自第二生心區(qū)，參與構(gòu)成流出道、右心室、右心房及少部分左心室。同時(shí)，Islt-1+CSCs 的表達(dá)還調(diào)控Bmp415 和Wnt 信號(hào)通路,這些信號(hào)通路的開啟會(huì)激活GATA4 和SRF（Serum response factor，血清反應(yīng)因子）的表達(dá)16。

1.5 心外膜干細(xì)胞（Epicardium-derived cells,EPDCs）CSCs的另一個(gè)來源是心臟外膜，有多組報(bào)道指出成人心臟外膜存在內(nèi)源性的心外膜干細(xì)胞，可以衍生出心肌和血管平滑肌17，并且EPDCs 還有誘導(dǎo)產(chǎn)生外膜纖維細(xì)胞、冠脈平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的潛能18,19,20。Madonna 等實(shí)驗(yàn)證明，人EPDCs 注射到有免疫缺陷的小鼠模型心肌，可以提高小鼠心臟EF值，并防止心肌的纖維性重塑21。

1.6 幾種特殊的CSCs形態(tài)

1.6.1 心肌球樣細(xì)胞群（cardiospheres）2004 年Elisa Messina22等從心肌中分離出一種特殊的具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群，他們稱之為球體樣細(xì)胞（Sphere-Forming Cells），通過免疫檢測，他們發(fā)現(xiàn)心肌球樣細(xì)胞群表達(dá)許多內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物KDR，flk-1，CD-31及干細(xì)胞表面標(biāo)記物C-kit，Sca-1，并且證明了這類細(xì)胞可以向內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞分化。

1.6.2 側(cè)群細(xì)胞 Hierlihy1 等首先從小鼠心肌細(xì)胞中分離出一類具有干細(xì)胞生物行為特征的細(xì)胞，將其命名為邊緣群細(xì)胞或者側(cè)群細(xì)胞（SidePopulation,SP），和新生心肌共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)SP 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。2002年，Kazumasa等對(duì)心臟SP細(xì)胞做了較為詳細(xì)的闡述23：他們指出心臟SP細(xì)胞通常表達(dá)Sca1而不表達(dá)造血細(xì)胞系的相關(guān)細(xì)胞標(biāo)記物，如CD34 和CD45。Oyama10 等首次描述了在體的SP 細(xì)胞的特性，GFP+新生SP可以向受損的心肌細(xì)胞遷移，增殖和分化成新生心肌細(xì)胞，修復(fù)受損的心肌細(xì)胞。與Oyama 研究相類似，Yew Liang24 的研究顯示，Sca+-CD31 SP 細(xì)胞在體外可以可以向心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化和增殖，并且，當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)，Sca+-CD31 SP細(xì)胞可以向受損細(xì)胞遷移，并且有成血管作用。

目前對(duì)CSCs的認(rèn)識(shí)仍然有限，因此對(duì)于CSCs的分類還比較混亂，沒有統(tǒng)一的分類方法，有研究指出了以上幾種不同細(xì)胞表面標(biāo)記物的CSCs之間有著很緊密的聯(lián)系，Konrad6 的研究表明，急性心梗的病人心肌中可以見到新生的CSCs，其中60%細(xì)胞C-kit、MDR、Sca-1 同時(shí)表達(dá)，而只有很少部分只表達(dá)單一一種或兩種表面標(biāo)記物，同時(shí)，有證據(jù)顯示25,26上述的某些CSCs 可能只是同一種干細(xì)胞的不同亞群，因此表面抗原區(qū)分CSCs 的方法雖然是目前分類CSCs的通用方法，但是其可靠性需要進(jìn)一步論證。

2 離子通道與CSCs

目前，離子通道對(duì)于干細(xì)胞的影響研究多集中在人類胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，HESCs）對(duì)象，而非CSCs，少數(shù)研究者有過對(duì)CSCs的研究，Yi H,27 等在對(duì)免疫磁珠方法分離出的小鼠Ckit+細(xì)胞離子通道研究中觀察到了三種類型的膜電流：延遲整流鉀電流（IKDR）、內(nèi)向整流鉀電流（IKir）、容積依賴性氯離子ICl vol，他們指出，離子通道的表達(dá)存在異質(zhì)性，這說明可能處于不同時(shí)期的細(xì)胞離子通道的表達(dá)不一致28。離子通道對(duì)CSCs 的作用還不是很清楚，研究也不多，還有比較大的研究空間29。

3 CSCs的臨床應(yīng)用與展望

雖然對(duì)于CSCs 的認(rèn)識(shí)還存在很多不確定和模糊，但應(yīng)該得到肯定的是CSCs 的臨床應(yīng)用前景。在治療急性心肌梗死和缺血性心肌病中，CSCs 具有巨大的潛力，美國心臟病協(xié)會(huì)（AHA）2012 科學(xué)會(huì)議上公布的缺血性心肌病患者心肌干細(xì)胞（CSC）注射小型研究“缺血性心肌病患者干細(xì)胞注射”（SCIPIO）試驗(yàn)的2 年隨訪結(jié)果顯示，2 年內(nèi)，接受“CSCs”注射的治療組LVEF 都有明顯提高，說明CSCs 對(duì)于恢復(fù)心臟的泵功能確實(shí)有效,CSCs 無論在心肌梗死后心肌再生及心功能恢復(fù)或者是構(gòu)建生物起搏器方面都有其不可替代的優(yōu)勢，有巨大的研究前景和研究價(jià)值。雖然CSCs已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)多年，但目前人們對(duì)于CSCs的認(rèn)識(shí)仍然較少，有很多甚至是空白，比如將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植回心臟后，有導(dǎo)致心律失常的報(bào)道，CSCs 移植回心臟會(huì)不會(huì)也有導(dǎo)致心律失常的表現(xiàn)，如何保證CSCs不向腫瘤細(xì)胞分化，誘導(dǎo)CSCs培養(yǎng)出的起搏樣細(xì)胞是否有時(shí)效性，除此之外，值得重點(diǎn)關(guān)注的是，新近對(duì)于microRNA 的深入研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在調(diào)控心臟發(fā)育方面也起著關(guān)鍵性的作用，尤其在心血管譜系細(xì)胞的分化中有很重要的作用，比如miRNA290-295 譜系被認(rèn)為參與了促進(jìn)ESC 增殖、及干細(xì)胞的分化多能性維持的調(diào)控30,31；miRNA-302-367譜系通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來維持ESC的增殖32；有報(bào)道指出miR134,miR-296 和miR470 在ESC 分化時(shí)處于上調(diào)狀態(tài)33，miRNA-145 不僅直接靶向抑制多能性因子Oct4,Sox2,and Klf4,還通過其過表達(dá)抑制ESC 自我更新，促進(jìn)不同譜系種類細(xì)胞形成34,SK4Ca+激活K+通道對(duì)于HESCs向心臟起搏細(xì)胞分化具有重要作用35，但是這些都是基于對(duì)ESC的研究，CSCs 是否有類似的效果還不得而知，因此這方面的研究空間和可研究性還很大。

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