骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性腦卒中的研究與應(yīng)用

謝 帆 綜述，湯永紅 審校

在過(guò)去的50 年里，關(guān)于缺血性腦卒中的治療進(jìn)行了大量臨床前和臨床試驗(yàn)，很少有藥物是有效的保護(hù)或修復(fù)受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。然而，近10 年的研究都強(qiáng)烈推薦，細(xì)胞移植治療各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。òX卒中）可能促進(jìn)功能恢復(fù)。多種細(xì)胞類型研究表明，作為細(xì)胞源植入中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動(dòng)物模型后，包括胚胎干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，臍帶血單核細(xì)胞，誘導(dǎo)式多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）和BMSC，可以在缺血后組織中生存，減輕神經(jīng)元損傷，修復(fù)神經(jīng)功能［1-3］。其中，BMSC 可能最具潛力，因?yàn)槠淇梢詮幕颊唧w內(nèi)獲得并不造成倫理或免疫困難。BMSC 是一種多潛能的非造血干細(xì)胞，具有自我增值、多系分化、免疫調(diào)節(jié)、歸巢擴(kuò)散能力，能分化成脂肪、骨、軟骨，也可以分化為于胚胎無(wú)關(guān)的組織，包括神經(jīng)細(xì)胞［4］。植入人工支架于受損部位能支持BMSC遷移，促進(jìn)缺血性腦的修復(fù)和再生［5］。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可大大提高BMSC 的遷移或到支架的侵襲，在缺血性腦損傷慢性期提供以后的再生潛力［6］。特別是粒細(xì)胞集落刺激因子（GCSF），可通過(guò)促進(jìn)BMC遷移至缺血性腦加強(qiáng)神經(jīng)和血管生成［7］。BMSC移植與其他先進(jìn)技術(shù)科學(xué)、合理的融合以治療缺血性腦卒中，為治療提供新方向，為卒中患者帶來(lái)新希望。

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性腦卒中的基礎(chǔ)科學(xué)研究

1.1 BMSC 的神經(jīng)再生、修復(fù)作用越來(lái)越多的證據(jù)表明，移植的BMSC 向受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織遷移，促進(jìn)腦梗死后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。最近的研究表明，BMSC還能改善由于慢性腦缺血導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙［8］?，F(xiàn)在，BMSC被認(rèn)為是通過(guò)分化成神經(jīng)細(xì)胞和產(chǎn)生各種細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，搶救和修復(fù)受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)；也可能通過(guò)釋放一些神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抑制炎癥反應(yīng)來(lái)支持宿主神經(jīng)細(xì)胞的生存［9-10］。在一定實(shí)驗(yàn)條件下，他們可以修改自己的基因表達(dá)譜，分化成神經(jīng)元細(xì)胞［11］。因此，BMSC 本身能表達(dá)相關(guān)基因的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)BMSC與公開(kāi)的神經(jīng)元興奮性氨基酸（谷氨酸）共同培養(yǎng)時(shí)，能顯著地增加可溶性神經(jīng)保護(hù)因子的釋放，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞損傷［12］。BMSC能顯著促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)的軸突生長(zhǎng),明顯促進(jìn)神經(jīng)元突觸在大腦和脊髓的延伸，增強(qiáng)梗塞周圍區(qū)域的幸存皮層神經(jīng)元的軸突發(fā)芽［13］。Chiba等［14］提出，BMSC 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)出旁觀者機(jī)制，通過(guò)釋放營(yíng)養(yǎng)分子，拯救神經(jīng)元，并促進(jìn)當(dāng)?shù)氐纳窠?jīng)前體細(xì)胞增殖和成熟，它們對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞可以有抗炎和抗增殖作用，保護(hù)神經(jīng)微環(huán)境。根據(jù)這些觀察，BMSC可以通過(guò)多種機(jī)制由異質(zhì)細(xì)胞群保護(hù)和修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

1.2 BMSC 的趨化、增殖能力BMSC 在腦內(nèi)移植后到達(dá)梗死腦依然有強(qiáng)大的增殖能力［15］。移植的BMSC 通過(guò)趨化因子系統(tǒng)向梗死組織遷移，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子［16］。大量研究證明，在梗塞周圍區(qū)移植的BMSC 為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)特定的蛋白質(zhì)［17-18］。最近的一項(xiàng)研究表明，移植的BMSC能表達(dá)γ-氨基丁酸（GABA）受體和增強(qiáng)與梗死周圍區(qū)的結(jié)合潛力［19］。

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性腦卒中的臨床試驗(yàn)

2.1 BMSC 的臨床試驗(yàn)現(xiàn)狀 如上所述，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的觀測(cè)是令人鼓舞的。針對(duì)缺血性腦卒中患者的BMSC 移植的一些臨床試驗(yàn)也已經(jīng)啟動(dòng)。Bussolino F 等［20］為50例缺血性腦卒中后5～9 周的嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損病癥，靜脈注射自體BMSC，得出結(jié)論，自體BMSC輸注是一個(gè)可行和安全的治療方法，可促進(jìn)功能恢復(fù)；Cai J等［21］為12例缺血性腦卒中后36～133天的患者靜脈移植BMSC；Lee JS等［22］完成了一項(xiàng)開(kāi)放式觀察52例缺血性腦卒中患者的雙盲臨床試驗(yàn)，并隨訪他們長(zhǎng)達(dá)5 年。他們的結(jié)論是，靜脈移植自體BMSC 治療缺血性腦卒中可能是一個(gè)安全和有效的策略。但是，我們應(yīng)該清楚地提醒，沒(méi)有任何臨床試驗(yàn)證明細(xì)胞治療的臨床意義，包括BMSC的移植。

2.2 BMSC 的臨床試驗(yàn)進(jìn)展及問(wèn)題 有許多變數(shù)可能會(huì)影響B(tài)MSC 移植在臨床中的療效。其中包括供體細(xì)胞（安全性、自體或同種異體、前體內(nèi)細(xì)胞的擴(kuò)展），患者因素（年齡和卒中類型），治療因素（發(fā)病間隔時(shí)間，臨床治療路徑和細(xì)胞劑量），驗(yàn)證因素（神經(jīng)系統(tǒng)的評(píng)估和成像）［23］?，F(xiàn)在是時(shí)候?yàn)榘l(fā)展神經(jīng)保護(hù)藥物從臨床前研究中的問(wèn)題吸取經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)了。

首先，同種異體細(xì)胞被允許在發(fā)病后24 小時(shí)內(nèi)使用，但需強(qiáng)制長(zhǎng)期免疫抑制劑藥物治療［24］?；颊咦泽wBMSC作為供體細(xì)胞是理想的，但他們需要幾個(gè)星期在前體內(nèi)擴(kuò)增。因此，建立一個(gè)可行的協(xié)議，安全、迅速擴(kuò)增BMSC 是關(guān)鍵。BMSC 在大多數(shù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中被包括胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。然而，胎牛血清攜帶朊病毒，存在病毒、或人畜共患病污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。雖然，自體血清可用于擴(kuò)增BMSC，但可能需要大量的血清。最近，人類血小板裂解液已被證實(shí)可作為BMSC 擴(kuò)增培養(yǎng)基的替代品。血小板裂解液中含介質(zhì)，能擴(kuò)增人類BMSC 并保留他們的遷移、存活和分化能力，立體定向移植到梗死腦時(shí)顯著促進(jìn)功能恢復(fù)［25］。因此，血小板裂解液可能是一個(gè)有臨床價(jià)值的和安全的替代胎牛血清擴(kuò)增BMSC 的方法。

第二，在大多數(shù)動(dòng)物研究中BMSC于腦卒中造模后24 小時(shí)或7 天之內(nèi)移植，而在之前的臨床試驗(yàn)中他們通常是在發(fā)病后數(shù)周（甚至是幾個(gè)月）后移植。因此，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的治療協(xié)議之間存在著相當(dāng)大的差距，這可能與臨床前試驗(yàn)不足相關(guān)。粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSFs）可能是有用的，一定濃度的G-CSFs 可顯著提高BMSC 的增殖能力，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，上調(diào)其產(chǎn)生的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-α［26］。因此，G-CSFs 可以加快治療缺血性腦卒中細(xì)胞的擴(kuò)增和縮短發(fā)病至移植治療之間的時(shí)間間隔。眾所周知，各種成體干細(xì)胞，包括BMSC 的老化會(huì)明顯降低自我更新和分化能力。這一事實(shí)將對(duì)BMSC 移植治療缺血性腦卒中的療效產(chǎn)生顯著影響。因?yàn)榇蠖鄶?shù)缺血性腦卒中患者年事已高。近期有研究表明，G-CSF在老年動(dòng)物中也能促進(jìn)BMSC的增殖能力和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放［27］。

第三，BMSC可以直接移植，或者靜脈、動(dòng)脈內(nèi)或鞘內(nèi)注射。直接（顱內(nèi)）注射使供體細(xì)胞最快捷地在受損組織中定植。靜脈內(nèi)或鞘內(nèi)注射移植是有吸引力的，因?yàn)樗且环N非侵入性的、安全的技術(shù)，但有報(bào)道稱相比直接移植它將導(dǎo)致更少的細(xì)胞遷移和功能恢復(fù)［28］。另外，動(dòng)脈內(nèi)注射BMSC非侵入性地交付給受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能是有價(jià)值的［29］。因此，需要制定最佳的移植技術(shù)，最大限度的安全和高效的服務(wù)患者。值得關(guān)注的是，組織工程技術(shù)可以提供另一個(gè)途徑來(lái)傳遞細(xì)胞。在其他器官如骨骼、軟骨、心臟和皮膚，可降解的生物材料已經(jīng)被接受作為一種有價(jià)值的“腳手架”來(lái)修復(fù)和穩(wěn)定移植的細(xì)胞。然而，只有少數(shù)研究表示支架對(duì)細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有效。最近一項(xiàng)研究表明，纖維基質(zhì)可提高BMSC的生存和遷移能力，對(duì)于缺血性腦卒中的治療是一個(gè)有用的材料［30］。熱可逆凝膠聚合物水凝膠為BMSC 提供一個(gè)合適的環(huán)境，也可能是一個(gè)候選支架［31］。然而，還沒(méi)有臨床試驗(yàn)進(jìn)行這種技術(shù)在細(xì)胞治療缺血性腦卒中療效的檢驗(yàn)。

最后，移植細(xì)胞在宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)連續(xù)和非侵入性的示蹤方法，這將是發(fā)展必不可缺的技術(shù)。磁共振成像、核醫(yī)學(xué)成像和光學(xué)成像為主要候選方式。供體細(xì)胞可以在磁共振成像識(shí)別超順磁性氧化鐵劑標(biāo)記［32］。磁共振成像可以直觀完整、不透明的有機(jī)體，在三維空間具有良好的空間分辨率，但因?yàn)殪`敏度低需要成像時(shí)間長(zhǎng)，因此減緩數(shù)據(jù)采集。核成像通過(guò)放射性示蹤劑標(biāo)記發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞。Tian F 等［33］通過(guò)99m TC-hexamethylpropylene（HMPAO）標(biāo)記BMSC，并通過(guò)導(dǎo)管將其注射到缺血性腦卒中患者，移植的細(xì)胞通過(guò)單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描展現(xiàn)。核成像可以檢測(cè)目標(biāo)，具有高靈敏度，但由于臨床上可用的示蹤劑的半衰期相對(duì)較短，長(zhǎng)期監(jiān)視供體細(xì)胞有困難。另外，光學(xué)成像技術(shù)也可作為移植的BMSC在受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)可視化的未來(lái)技術(shù)。量子點(diǎn)發(fā)射近紅外熒光，具有較長(zhǎng)的波長(zhǎng)（800 納米），可以很容易地穿透生物活體組織。近期的研究表明，當(dāng)量子點(diǎn)標(biāo)記的BMSC 移植到大鼠梗死腦組織，至少8 周后，仍可以通過(guò)體內(nèi)熒光成像在頭骨和頭皮下清晰可見(jiàn)［34］。成像技術(shù)在BMSC 移植對(duì)宿主大腦功能影響的評(píng)估將是有臨床價(jià)值的。

3 展 望

上文總結(jié)了BMSC 目前的基礎(chǔ)科學(xué)進(jìn)展和早期先進(jìn)的臨床應(yīng)用。最近的研究已經(jīng)強(qiáng)烈建議BMSC移植治療缺血性腦卒中。但BMSC 的作用機(jī)制及臨床應(yīng)用設(shè)置等方面仍有待進(jìn)一步研究。最新研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞和血管成分之間一個(gè)重要的互動(dòng)組件如神經(jīng)血管單元，成為缺血性腦卒中潛在的治療目標(biāo)［35］。近期指出兩個(gè)除了壞死和凋亡之外的神經(jīng)細(xì)胞死亡機(jī)制：誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和轉(zhuǎn)錄抑制非典型死亡，為卒中的治療提供新的方向［36］。神經(jīng)血管單元和額外的細(xì)胞死亡機(jī)制，對(duì)干細(xì)胞療法的潛在療效及研究方向的影響是未來(lái)研究的主題。而且，進(jìn)一步的研究將為臨床設(shè)置建立一個(gè)科學(xué)的行之有效的策略。此外，干細(xì)胞治療與其他技術(shù)如血管再通操作相結(jié)合，將為患者提供額外的福利。

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