基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的臨床價值

羅一鈞

[摘要] 目的 探討基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的臨床價值。方法 回顧性分析685例結(jié)核病臨床疑似病例的臨床資料，采用晶芯結(jié)核分枝桿菌生物芯片技術(shù)進(jìn)行檢測。 結(jié)果 本組685例臨床疑似病例中，陽性135例，陽性率為19.7%，基因芯片檢測結(jié)果顯示結(jié)核131例，非結(jié)核4例，陽性率為19.1%。耐藥基因檢測68例，利福平和異煙肼基因突變12例，總突變率為17.6%，其中11例為利福平和異煙肼均耐藥，雙重基因突變率為16.2%，另1例只耐利福平。利福平總突變率為17.6%，異煙肼總突變率為16.2%，耐多藥率為16.2%。 結(jié)論 晶芯結(jié)核分枝桿菌生物芯片技術(shù)用于臨床診斷結(jié)核病及其耐藥性，能夠縮短診斷時間，提高臨床時效性，值得推廣應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核分枝桿菌；基因芯片；結(jié)核病診斷

[中圖分類號] R378.91+1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）01（b）-0123-03

國內(nèi)每年有將近13萬人因結(jié)核病死亡[1]，且有將近12萬新發(fā)耐多藥結(jié)核病患者，未來數(shù)年內(nèi)可能出現(xiàn)耐藥菌為主的流行態(tài)勢[2]。目前，結(jié)核病診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法主要包括分枝桿菌分離培養(yǎng)、抗酸菌痰涂片鏡檢、菌種鑒定和藥敏試驗等，但是其普遍存在特異性差、靈敏度低或需時長的缺點[3]，本院引進(jìn)國內(nèi)最新的結(jié)核診斷技術(shù)——晶芯結(jié)核分枝桿菌生物芯片診斷系統(tǒng)，是近年發(fā)展起來的進(jìn)行大規(guī)模遺傳多態(tài)性檢測的新方法[4]，其應(yīng)用于臨床診斷結(jié)核病，提高了時效性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本院2013年3月1日～2013年9月30日接受診治的結(jié)核病臨床疑似病例共685例，其中男性363例，女性322例；年齡9～76歲，平均（34.51±2.28）歲；其中臨床診斷結(jié)核病病例681例，包括185例痰結(jié)核菌培養(yǎng)陰性肺結(jié)核，157例痰結(jié)核菌培養(yǎng)陽性肺結(jié)核，193例結(jié)核性腦膜炎，95例結(jié)核性胸膜炎，51例骨結(jié)核。非結(jié)核分枝桿菌病4例。

1.2 試劑與儀器

Extractor 36核酸提取儀、BioMixerⅡ芯片雜交儀、Slider Washer芯片洗干儀、LuxScan 10 K-B芯片掃描儀、晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒、晶芯結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒，均購自博奧生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的處理 以痰樣本為例（其余樣本同痰樣本處理方法）：①向痰液中加入等體積10%NaOH，渦旋振蕩，充分液化均勻，也可37℃液化30 min后再振蕩；②取1 ml液化后的痰液轉(zhuǎn)入1.5 ml Eppendorf管中，12 000 r/min，5 min，棄去上清；③加入1 ml生理鹽水，渦旋振蕩后12 000 r/min，5 min，棄去上清。

1.3.2 核酸提取 ①向處理好的標(biāo)本管內(nèi)加入80 μl核酸提取液，用加樣器混勻后轉(zhuǎn)入核酸提取管內(nèi)；②用核酸快速提取儀振蕩10 min，然后95℃水浴5 min。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 ①從B試劑盒取出PCR擴(kuò)增試劑，自然解凍后輕搖，迅速離心后分裝18 μl至八聯(lián)排管中，加上蓋，標(biāo)上編號；②加入2 μl樣本核酸溶液，用加樣器吸打混勻；③上機(jī)擴(kuò)增。

1.3.4 芯片雜交 ①將PCR產(chǎn)物置PCR儀擴(kuò)增95℃變性5 min，隨后立即放入冰水混合物中，驟冷冰浴3 min；②取9 μl雜交緩沖液至八聯(lián)排管中，再按樣品順序加6 μl PCR產(chǎn)物；③準(zhǔn)備雜交盒，將14 μl雜交混合物加入芯片點陣中，完成后且金屬封條密封雜交盒；④放入雜交儀內(nèi)50℃雜交2 h；⑤將芯片洗干，甩水。

1.3.5 芯片掃描結(jié)果判讀 開啟掃描儀，預(yù)熱激光10 min，輸入芯片編號，樣本信息，選擇樣本，開始掃描，并判讀結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌基因芯片檢測對結(jié)核病的診斷結(jié)果

本組結(jié)核菌基因檢測685例臨床疑似病例中，陽性患者135例，陽性率為19.7%，通過基因芯片檢測結(jié)果顯示，結(jié)核患者131例，非結(jié)核患者4例，陽性率為19.1%。

2.2 結(jié)核分枝桿菌基因芯片法耐藥基因變異的檢測結(jié)果

隨機(jī)選取68例陽性患者進(jìn)行耐藥基因檢測，通過基因芯片檢測結(jié)果顯示，12例患者發(fā)生基因突變，總突變率為17.6%；其中11例患者為利福平和異煙肼雙重基因突變，雙重基因突變率為16.2%，另1例只發(fā)生利福平基因突變；耐多藥率為16.2%。利福平總突變率為17.6%，其中9例為531（C-T）位點突變，3例為526（C-T）位點突變；異煙肼總突變率為16.2%，其中7例患者為katG 315（G-C）位點突變，3例為inhA-15（C-T）位點突變，1例為katG 315（G-A）位點突變。

3 討論

結(jié)核病嚴(yán)重危害人民群眾的身心健康，已經(jīng)成為全球共同關(guān)注的重大社會問題和公共衛(wèi)生問題[5]。目前，結(jié)核病診斷的主要方法包括分枝桿菌分離培養(yǎng)、抗酸菌痰涂片鏡檢、菌種鑒定和藥敏試驗等，存在極易漏檢、敏感性低或時效性差的問題，培養(yǎng)法需要4周左右才能獲得結(jié)果，而藥敏試驗法則需要8周，耐藥性不能盡早檢出結(jié)果，不僅會嚴(yán)重延誤診斷，更會引起臨床治療推遲，甚至導(dǎo)致治療失敗[6]，同時，也助長了耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播及流行，可能造成出現(xiàn)耐多藥結(jié)核，從而加劇了預(yù)防和控制結(jié)核病的艱巨性，因此，臨床上能夠找到快速診斷結(jié)核感染和耐藥結(jié)核病的新型診斷工具對結(jié)核預(yù)防控制的有效性有重大意義[7]。目前，基因芯片技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于臨床，其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速檢測和高通量的特點，為有效預(yù)防和控制結(jié)核病提供了一個新的快速、高效、實用的分子診斷平臺[8]，同時為結(jié)核病的篩查、合理用藥和疫情監(jiān)控提供了準(zhǔn)確且高效的應(yīng)用指導(dǎo)。

本院采用晶芯結(jié)核分枝桿菌生物芯片診斷系統(tǒng)診斷結(jié)核病，是博奧生物與結(jié)核病國家參比實驗室經(jīng)過對分枝桿菌菌種快速鑒定和結(jié)核耐藥快速檢測開展的合作研究，研制的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒和結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒，是國內(nèi)最新的結(jié)核診斷技術(shù)。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，基因芯片法具有檢測時間短和通量高的特點[9]。分枝桿菌菌種鑒定試劑盒能夠快速檢測結(jié)核等17種臨床上多見的分枝桿菌，結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒能夠快速檢測利福平和異煙肼的耐藥性，同時可將6～8周的常規(guī)檢測時間縮減到6 h[10]，這兩款試劑盒能夠成功應(yīng)用于臨床實踐，明顯縮短了復(fù)雜疑難疾病的確診時間，同時對結(jié)核耐藥做到早期篩選，并可指導(dǎo)患者合理用藥。

晶芯結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定和耐藥基因檢測采用的是DNA微陣列芯片技術(shù)，可通過對常見臨床樣本中的分枝桿菌核酸進(jìn)行檢測，快速獲取臨床常見致病分枝桿菌的準(zhǔn)確種屬信息。該產(chǎn)品主要用于結(jié)核病和非結(jié)核分枝桿菌病的輔助診斷，也可用于流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域，具有靈敏、準(zhǔn)確、快捷、先進(jìn)、高效的特點。

綜上所述，采用晶芯結(jié)核分枝桿菌生物芯片診斷系統(tǒng)用于臨床診斷結(jié)核病及其耐藥性，能夠縮短診斷時間，提高臨床時效性，得到了良好的社會效益，值得推廣應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 謝士達(dá)，劉永成，張鳳池，等.基因芯片技術(shù)快速檢測結(jié)核分枝桿菌異煙肼、利福平耐藥性[J].臨床肺科雜志， 2008，13（2）：147-149.

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[10] 康麗菲，朱桂云，李秀武，等.基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼耐藥性的研究[J].河北醫(yī)藥， 2012，34（16）：2412-2414.

（收稿日期：2013-10-18 本文編輯：許俊琴）

本院采用晶芯結(jié)核分枝桿菌生物芯片診斷系統(tǒng)診斷結(jié)核病，是博奧生物與結(jié)核病國家參比實驗室經(jīng)過對分枝桿菌菌種快速鑒定和結(jié)核耐藥快速檢測開展的合作研究，研制的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒和結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒，是國內(nèi)最新的結(jié)核診斷技術(shù)。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，基因芯片法具有檢測時間短和通量高的特點[9]。分枝桿菌菌種鑒定試劑盒能夠快速檢測結(jié)核等17種臨床上多見的分枝桿菌，結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒能夠快速檢測利福平和異煙肼的耐藥性，同時可將6～8周的常規(guī)檢測時間縮減到6 h[10]，這兩款試劑盒能夠成功應(yīng)用于臨床實踐，明顯縮短了復(fù)雜疑難疾病的確診時間，同時對結(jié)核耐藥做到早期篩選，并可指導(dǎo)患者合理用藥。

晶芯結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定和耐藥基因檢測采用的是DNA微陣列芯片技術(shù)，可通過對常見臨床樣本中的分枝桿菌核酸進(jìn)行檢測，快速獲取臨床常見致病分枝桿菌的準(zhǔn)確種屬信息。該產(chǎn)品主要用于結(jié)核病和非結(jié)核分枝桿菌病的輔助診斷，也可用于流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域，具有靈敏、準(zhǔn)確、快捷、先進(jìn)、高效的特點。

綜上所述，采用晶芯結(jié)核分枝桿菌生物芯片診斷系統(tǒng)用于臨床診斷結(jié)核病及其耐藥性，能夠縮短診斷時間，提高臨床時效性，得到了良好的社會效益，值得推廣應(yīng)用。

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[10] 康麗菲，朱桂云，李秀武，等.基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼耐藥性的研究[J].河北醫(yī)藥， 2012，34（16）：2412-2414.

（收稿日期：2013-10-18 本文編輯：許俊琴）

本院采用晶芯結(jié)核分枝桿菌生物芯片診斷系統(tǒng)診斷結(jié)核病，是博奧生物與結(jié)核病國家參比實驗室經(jīng)過對分枝桿菌菌種快速鑒定和結(jié)核耐藥快速檢測開展的合作研究，研制的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒和結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒，是國內(nèi)最新的結(jié)核診斷技術(shù)。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，基因芯片法具有檢測時間短和通量高的特點[9]。分枝桿菌菌種鑒定試劑盒能夠快速檢測結(jié)核等17種臨床上多見的分枝桿菌，結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒能夠快速檢測利福平和異煙肼的耐藥性，同時可將6～8周的常規(guī)檢測時間縮減到6 h[10]，這兩款試劑盒能夠成功應(yīng)用于臨床實踐，明顯縮短了復(fù)雜疑難疾病的確診時間，同時對結(jié)核耐藥做到早期篩選，并可指導(dǎo)患者合理用藥。

晶芯結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定和耐藥基因檢測采用的是DNA微陣列芯片技術(shù)，可通過對常見臨床樣本中的分枝桿菌核酸進(jìn)行檢測，快速獲取臨床常見致病分枝桿菌的準(zhǔn)確種屬信息。該產(chǎn)品主要用于結(jié)核病和非結(jié)核分枝桿菌病的輔助診斷，也可用于流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域，具有靈敏、準(zhǔn)確、快捷、先進(jìn)、高效的特點。

綜上所述，采用晶芯結(jié)核分枝桿菌生物芯片診斷系統(tǒng)用于臨床診斷結(jié)核病及其耐藥性，能夠縮短診斷時間，提高臨床時效性，得到了良好的社會效益，值得推廣應(yīng)用。

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[6] 李衛(wèi)彬，李新旭，張彤群，等.基因芯片檢測技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌異煙肼和利福平耐藥的實際應(yīng)用效果評價[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2012，6（16）：4666-4670.

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[9] 歐維正，駱科文，王燕，等.基因芯片和比例法藥物敏感性試驗檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼耐藥性的比較研究[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2013，28（5）：404-407.

[10] 康麗菲，朱桂云，李秀武，等.基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼耐藥性的研究[J].河北醫(yī)藥， 2012，34（16）：2412-2414.

（收稿日期：2013-10-18 本文編輯：許俊琴）