應(yīng)用微生物法試劑盒檢測奶粉中維生素B6的含量

鄭悅康　葉志英　劉綺明

[摘要] 目的 建立應(yīng)用微生物法試劑盒檢測奶粉中維生素B6含量的分析方法。 方法 采用維生素B6微生物檢測試劑盒定量檢測奶粉中添加維生素B6的含量。 結(jié)果 維生素B6的線性范圍為0.002～0.012 mg/100 g（ml），檢出限為0.002 mg/100 g（ml），其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9987，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%，其回收率達到90.0%～108%。 結(jié)論 微生物法試劑盒具有靈敏度高，檢出限低，線性范圍寬，操作方法簡便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點，可用于奶粉中維生素B6的檢測工作。

[關(guān)鍵詞] 維生素B6；吡哆醇；微生物法

[中圖分類號] R155.5 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）02（a）-0012-03

維生素B6是所有呈現(xiàn)吡哆醛生物活性的3-羥基-2-甲基吡啶衍生物的總稱，主要是吡哆醛、吡哆胺和吡哆醇，在自然界廣泛分布，其磷酸化形式是氨基酸代謝過程的輔酶，如轉(zhuǎn)氨酶的輔酶。加入食品中的維生素B6通常為鹽酸吡哆醇或5-磷酸吡哆醇形式，5-磷酸吡哆醇也以維生素B6衍生物的形式天然存在于食品中。主要臨床應(yīng)用有：維生素B6缺乏癥、嬰兒驚厥、血紅蛋白缺陷所致的貧血、放射病及某些抗癌藥物引起的惡心、嘔吐或妊娠嘔吐的治療[1]。據(jù)報道每天補充40 mg維生素B6可以防止動脈粥樣硬化的發(fā)展。研究表明，當(dāng)維生素B6達到一定血藥濃度時，還可以與血小板表面蛋白質(zhì)、纖維蛋白原及凝血酶原等凝血物質(zhì)結(jié)合，從而阻止血小板聚集，防止血液凝固，延長凝血時間，使血栓不易形成，因而具有預(yù)防腦血栓的藥理作用[2]。目前，市場上出售的奶粉成分中一般都含有維生素B6，特別在嬰幼兒配方奶粉中是必需添加的一種維生素。測定食品中維生素B6的方法有化學(xué)法和生物法，化學(xué)法主要是儀器分析如液相色譜法[3-4]、氣相色譜法[5]、熒光光度法[6-7]、紫外分光光度法[8-9]等。生物法也叫微生物法，其優(yōu)勢則在于：①它是以應(yīng)用微生物試驗對象為基礎(chǔ)，測的是生物活性含量，更具生物學(xué)意義；②微生物作為一種活試劑，具有自身的特異性和高度的靈敏性，使測定結(jié)果較化學(xué)方法更為準(zhǔn)確?；谶@些原因，GB/T5009.154-2003將微生物法規(guī)定為測定食品中維生素B6的國家標(biāo)準(zhǔn)方法[10-11]。

本次研究所用的試劑盒利用微生物法的原理，將維生素B6檢測培養(yǎng)基和稀釋后的樣品提取液加入包被有釀酒酵母的微孔中。釀酒酵母的生長離不開維生素B6，加入維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品或含維生素B6的樣品后，釀酒酵母開始生長直至維生素被完全消耗。30℃避光44～48 h完全孵育。釀酒酵母的代謝或生長強度與提取液中維生素B6的含量有關(guān)，可通過在610～630 nm或540～550 nm下采用酶標(biāo)儀讀取溶液混濁度獲得，將樣品濁度與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比即可得到樣品中維生素B6含量。

1 材料與方法

1.1 儀器

Sunrise酶標(biāo)儀（奧地利TECAN）、電子分析天平（上海梅特勒）、離心機（上海安亭）、恒溫培養(yǎng)箱（德國BINDER）。

1.2 試劑

VitaFast維生素B6（吡哆醇）檢測試劑盒（北京博歐實德生物技術(shù)有限公司提供）；鹽酸吡哆醇（維生素B6）純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度99.7%，中國計量科學(xué)研究院生產(chǎn)）；酸性馬鈴薯磷酸酶（美國Sigma生產(chǎn)）；枸櫞酸鹽緩沖液（pH4.5）：將1.5 g枸櫞酸一水化合物加入100 ml燒杯中，加入50 ml無菌水，邊攪拌邊溶解，然后加入12 ml NaOH（1 mol/L），用0.1 mol/L HCl將pH調(diào)至4.5，將溶液定量轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，用無菌水定容；實驗用水均為滅菌超純水；樣品均為市售奶粉。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液 準(zhǔn)確稱取鹽酸吡哆醇（維生素B6）純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.050 g，用枸櫞酸鹽緩沖液溶解并定容至100 ml棕色容量瓶中，配成50 mg/100 ml溶液，置于冰箱中保存以備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液 在測定時，將標(biāo)準(zhǔn)儲備液按比例用枸櫞酸鹽緩沖液準(zhǔn)確稀釋成濃度為10 mg/100 ml、25 mg/100 ml。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取1 g均質(zhì)后的樣品，將其加入50 ml無菌離心管中，加入20 ml枸櫞酸鹽緩沖液，振蕩混勻，加入10 mg酸性馬鈴薯磷酸酶，振蕩混勻，37℃避光孵育1 h，同時間歇性振蕩，用無菌水補至40 ml。振蕩混勻后，在95℃水浴中提取30 min，期間應(yīng)至少混合5次，然后快速冷卻至30℃以下，在>8000 g下離心5 min。根據(jù)維生素B6的濃度范圍，在1.5 ml無菌離心管中應(yīng)用無菌水對上清液進一步稀釋成100倍或以上，使測定OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

1.5 檢測步驟

取出所需數(shù)量的微孔板條并在板上固定，依次將150 μl維生素B6檢測培養(yǎng)基、150 μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品稀釋液加入微孔中，用黏合箔蓋住微孔條或微孔。在30℃培養(yǎng)箱中避光孵育44～48 h。再次向下擠壓黏合箔，將微孔板向上放置在桌面上，在桌面平面上振蕩，使微生物溶解在培養(yǎng)基中。小心揭開黏合箔，用移液槍頭破壞微孔液體表面所有的泡沫。用酶標(biāo)儀在620 nm條件下測量渾濁度。

1.6 結(jié)果計算

應(yīng)用4參數(shù)法進行結(jié)果計算。4參數(shù)法是指用含有4個參數(shù)的方程表示因變量（Y）隨自變量（X）變化的規(guī)律。目前最常用于免疫檢測領(lǐng)域，用于描述吸光度隨抗原濃度變化的規(guī)律，四參數(shù)模式為Y=D+（A-D）/[1+（X/C）^B]。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別移取維生素B6的標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液（試劑盒自帶）按比例稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0.002、0.004、0.006、0.008、0.012 mg/100 g。以標(biāo)準(zhǔn)系列中的維生素B6濃度為橫坐標(biāo)，酶標(biāo)儀的測量OD值為縱坐標(biāo)繪制維生素B6的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。4參數(shù)曲線法線性回歸方程為Y=-0.012 763 0+（1.530 362 86+0.012 276 30）/[1+（X/0.006 597 79）^（-1.455 190 92）]，其相關(guān)系數(shù)為0.9987。

圖1 維生素B6的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的精密度分析

將進行樣品處理的4種不同的奶粉樣品分別進行6次維生素B6測定，得出不同樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值（表1）。

表1 精密度分析（n=6）

2.3 方法的加標(biāo)回收率

將兩種不同的奶粉樣品，分別加入質(zhì)量濃度為10、25、50 mg/100 ml的維生素B6標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μl，再按樣品處理的步驟進行處理，然后平行測定6次，得到不同樣品的加標(biāo)回收率（表2）。

表2 加標(biāo)回收試驗（n=6）

3 討論

由于維生素B6是水溶性維生素，在高溫、光線直射、空氣暴露等環(huán)境條件下，會部分降解損失，故在樣品提取操作過程中，要盡可能在避光條件下操作，標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)在冷藏、避光條件下保存并盡快分析。含樣品的微孔板在30℃培養(yǎng)箱中避光孵育后，將其放于2～8℃冰箱保存，分別于24、48、72 h取微孔板用酶標(biāo)儀在620 nm條件下測量渾濁度，結(jié)果顯示48 h內(nèi)微孔板中的維生素B6性質(zhì)穩(wěn)定。

加入微孔中的樣品提取液，樣品稀釋液用水，以及實驗中需要的其他耗材都必須無菌。樣品無菌提取后，也必須在無菌環(huán)境中進行操作。要保證黏合膜和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分，防止樣品液在振蕩過程中相互混合影響測量結(jié)果。檢測樣品前要估算樣品中維生素B6的含量進行稀釋，稀釋過程要準(zhǔn)確，樣品的測量OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中部的結(jié)果可信度較高。

微生物法測定維生素B6的含量近50年來雖然已被廣泛地納入各類國際標(biāo)準(zhǔn)方法中，但在我國應(yīng)用卻很少。微生物法操作繁瑣、實驗周期長，與目前分析方法簡便、快速、高效的發(fā)展方向所不符[12]。因此，微生物檢測試劑盒通過優(yōu)化樣品處理、試劑配制、反應(yīng)條件，省略了菌種保存及種子培養(yǎng)液的制備[13]，能有效地簡化實驗步驟，排除實驗過程中的各種干擾，從而達到節(jié)省實驗時間、減輕工作量，進而得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果的目的，同時該方法檢出限、線性關(guān)系、精密度、加標(biāo)回收率、穩(wěn)定性等技術(shù)參數(shù)能滿足奶粉中維生素B6的微量分析的要求，表明該方法可用于測定奶粉中維生素B6的含量，結(jié)果令人滿意。

[參考文獻]

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[11] 王為黎，馬景宏，張旭，張志宏.運用微生物法測定保健食品中的維生素B6[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2006，18（4）：291-295.

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[13] 陳亞波，周敏，楊彤.微生物法測定維生素飲料中的維生素B6[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（12）：5502-5503，5509.

（收稿日期：2013-12-02 本文編輯：郭靜娟）

圖1 維生素B6的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的精密度分析

將進行樣品處理的4種不同的奶粉樣品分別進行6次維生素B6測定，得出不同樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值（表1）。

表1 精密度分析（n=6）

2.3 方法的加標(biāo)回收率

將兩種不同的奶粉樣品，分別加入質(zhì)量濃度為10、25、50 mg/100 ml的維生素B6標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μl，再按樣品處理的步驟進行處理，然后平行測定6次，得到不同樣品的加標(biāo)回收率（表2）。

表2 加標(biāo)回收試驗（n=6）

3 討論

由于維生素B6是水溶性維生素，在高溫、光線直射、空氣暴露等環(huán)境條件下，會部分降解損失，故在樣品提取操作過程中，要盡可能在避光條件下操作，標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)在冷藏、避光條件下保存并盡快分析。含樣品的微孔板在30℃培養(yǎng)箱中避光孵育后，將其放于2～8℃冰箱保存，分別于24、48、72 h取微孔板用酶標(biāo)儀在620 nm條件下測量渾濁度，結(jié)果顯示48 h內(nèi)微孔板中的維生素B6性質(zhì)穩(wěn)定。

加入微孔中的樣品提取液，樣品稀釋液用水，以及實驗中需要的其他耗材都必須無菌。樣品無菌提取后，也必須在無菌環(huán)境中進行操作。要保證黏合膜和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分，防止樣品液在振蕩過程中相互混合影響測量結(jié)果。檢測樣品前要估算樣品中維生素B6的含量進行稀釋，稀釋過程要準(zhǔn)確，樣品的測量OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中部的結(jié)果可信度較高。

微生物法測定維生素B6的含量近50年來雖然已被廣泛地納入各類國際標(biāo)準(zhǔn)方法中，但在我國應(yīng)用卻很少。微生物法操作繁瑣、實驗周期長，與目前分析方法簡便、快速、高效的發(fā)展方向所不符[12]。因此，微生物檢測試劑盒通過優(yōu)化樣品處理、試劑配制、反應(yīng)條件，省略了菌種保存及種子培養(yǎng)液的制備[13]，能有效地簡化實驗步驟，排除實驗過程中的各種干擾，從而達到節(jié)省實驗時間、減輕工作量，進而得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果的目的，同時該方法檢出限、線性關(guān)系、精密度、加標(biāo)回收率、穩(wěn)定性等技術(shù)參數(shù)能滿足奶粉中維生素B6的微量分析的要求，表明該方法可用于測定奶粉中維生素B6的含量，結(jié)果令人滿意。

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[12] 張旭，李援，胡英.微生物分析方法測定保健食品中維生素B6的含量[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2005，17（6）：477-478.

[13] 陳亞波，周敏，楊彤.微生物法測定維生素飲料中的維生素B6[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（12）：5502-5503，5509.

（收稿日期：2013-12-02 本文編輯：郭靜娟）

圖1 維生素B6的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的精密度分析

將進行樣品處理的4種不同的奶粉樣品分別進行6次維生素B6測定，得出不同樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值（表1）。

表1 精密度分析（n=6）

2.3 方法的加標(biāo)回收率

將兩種不同的奶粉樣品，分別加入質(zhì)量濃度為10、25、50 mg/100 ml的維生素B6標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μl，再按樣品處理的步驟進行處理，然后平行測定6次，得到不同樣品的加標(biāo)回收率（表2）。

表2 加標(biāo)回收試驗（n=6）

3 討論

由于維生素B6是水溶性維生素，在高溫、光線直射、空氣暴露等環(huán)境條件下，會部分降解損失，故在樣品提取操作過程中，要盡可能在避光條件下操作，標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)在冷藏、避光條件下保存并盡快分析。含樣品的微孔板在30℃培養(yǎng)箱中避光孵育后，將其放于2～8℃冰箱保存，分別于24、48、72 h取微孔板用酶標(biāo)儀在620 nm條件下測量渾濁度，結(jié)果顯示48 h內(nèi)微孔板中的維生素B6性質(zhì)穩(wěn)定。

加入微孔中的樣品提取液，樣品稀釋液用水，以及實驗中需要的其他耗材都必須無菌。樣品無菌提取后，也必須在無菌環(huán)境中進行操作。要保證黏合膜和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分，防止樣品液在振蕩過程中相互混合影響測量結(jié)果。檢測樣品前要估算樣品中維生素B6的含量進行稀釋，稀釋過程要準(zhǔn)確，樣品的測量OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中部的結(jié)果可信度較高。

微生物法測定維生素B6的含量近50年來雖然已被廣泛地納入各類國際標(biāo)準(zhǔn)方法中，但在我國應(yīng)用卻很少。微生物法操作繁瑣、實驗周期長，與目前分析方法簡便、快速、高效的發(fā)展方向所不符[12]。因此，微生物檢測試劑盒通過優(yōu)化樣品處理、試劑配制、反應(yīng)條件，省略了菌種保存及種子培養(yǎng)液的制備[13]，能有效地簡化實驗步驟，排除實驗過程中的各種干擾，從而達到節(jié)省實驗時間、減輕工作量，進而得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果的目的，同時該方法檢出限、線性關(guān)系、精密度、加標(biāo)回收率、穩(wěn)定性等技術(shù)參數(shù)能滿足奶粉中維生素B6的微量分析的要求，表明該方法可用于測定奶粉中維生素B6的含量，結(jié)果令人滿意。

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（收稿日期：2013-12-02 本文編輯：郭靜娟）