桑葉總黃酮不同純化工藝的比較

林秀仙　羅愛勤　陳亮

[摘要] 目的 比較桑葉總黃酮不同的純化工藝，為找到一種總黃酮含量>15%，簡便可行，廉價且適于生產(chǎn)的純化工藝。 方法 采用D101型、AB-8型和JD-1型大孔吸附樹脂吸附法，乙酸乙酯萃取法，醇提水沉法，醇提-水沉-醇沉法6種方法對桑葉總黃酮進行純化，以總黃酮的收率和含量為考察指標進行評價。 結果 6種方法制備的總黃酮的百分含量依次為：50.3%、48.5%、55.7%、82.1%、10.8%、18.5%，產(chǎn)品收率依次為：2.37%、2.42%、2.28%、0.45%、18.21%、15.93%。 結論 采用醇提-水沉-醇沉法即可得到符合要求的桑葉總黃酮。

[關鍵詞] 桑葉；總黃酮；純化工藝

[中圖分類號] R284 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）02（a）-0010-03

桑葉為桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥葉，味甘、苦，性寒，歸肺、肝經(jīng)；具有疏散風熱，清肺潤燥，清肝明目的功效；用于風熱感冒，肺熱燥咳，頭昏頭痛，目赤昏花等癥[1]。桑葉的生物活性物質(zhì)主要有黃酮類化合物、生物堿、多糖、桑葉蛋白等[2]，其中黃酮類化合物含有桑色素、蕓香苷、槲皮素、異槲皮素、紫云英苷等，含量占干葉重的1.0%～3.0%，是植物中莖葉黃酮類化合物含量較高的一種[3]。黃酮類化合物作為桑葉的重要活性成分之一，具有抗氧化、降血壓、降血脂、降血糖、防止動脈硬化和抗衰老等功效[4]。桑葉中總黃酮類化合物的常用提取方法是：以濃度約為70%的乙醇為提取溶劑，用浸漬法、超聲波法或加熱回流法等進行提取[3-7]。本實驗以70%乙醇為溶劑，加熱回流提取桑葉后，分別考察了不同的純化工藝，并以總黃酮為考察指標，制備含量達15%以上的桑葉總黃酮，為桑葉總黃酮的進一步開發(fā)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

桑葉（廣東廣弘藥材有限公司，20130701），蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，100080-200707），D101型大孔樹脂、AB-8型大孔樹脂、JD-1型大孔樹脂（凈品型，天津農(nóng)藥股份有限公司樹脂分公司），95%乙醇（醫(yī)用級），水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申科機械研究所），YZG-1000A型真空干燥機（常州市范群干燥設備有限公司），BS210S型電子天平（德國賽多利斯），UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司），層析柱（直徑2.5 cm×50 cm）。

2 方法與結果

2.1 桑葉總黃酮的純化方法

2.1.1 桑葉總黃酮的提取 稱取桑葉1 kg，加入10倍量70%乙醇，加熱回流提取2次，1.5 h/次，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至無乙醇氣味，加水稀釋至10 L，備用。

2.1.2 D101型樹脂吸附法 稱取已處理好的D101型樹脂50 g，用濕法裝柱法裝入層析柱（直徑2.5 cm×50 cm）中。將“2.1.1”中稀釋的水溶液500 ml，加入樹脂柱內(nèi)，控制流速為2～4 ml/min。當溶液全部吸附后，用蒸餾水（3 ml/min）洗脫至流出液無色。再用70%乙醇400 ml洗脫，洗脫速度3～5 ml/min，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮、干燥，干燥物稱重，并用紫外分光光度法測固體物中的總黃酮含量[8-10]。

2.1.3 AB-8型樹脂吸附法 稱取已處理好的AB-8型樹脂50 g，用濕法裝柱法裝入層析柱（直徑2.5 cm×50 cm）中。將“2.1.1”中稀釋的水溶液500 ml，加入樹脂柱內(nèi)，控制流速為2～4 ml/min。當溶液全部吸附后，用蒸餾水（3 ml/min）洗脫至流出液無色。再用70%乙醇400 ml洗脫，洗脫速度3～5 ml/min，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮、干燥，干燥物稱重，并用紫外分光光度法測固體物中的總黃酮含量。

2.1.4 JD-1型樹脂吸附法 稱取已處理好的JD-1型樹脂50 g，用濕法裝柱法裝入層析柱（直徑2.5 cm×50 cm）中。將“2.1.1”中稀釋的水溶液500 ml，加入樹脂柱內(nèi)，控制流速為2～4 ml/min。當溶液全部吸附后，用蒸餾水（3 ml/min）洗脫至流出液無色。再用70%乙醇400 ml洗脫，洗脫速度3～5 ml/min，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮、干燥，干燥物稱重，并用紫外分光光度法測固體物中的總黃酮含量。

2.1.5 乙酸乙酯萃取法 取“2.1.1”中稀釋的水溶液500 ml，減壓濃縮成100 ml，置250 ml分液漏斗中，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次用100 ml。合并3次萃取的乙酸乙酯，減壓濃縮，轉(zhuǎn)至蒸發(fā)皿中，在水浴上將乙酸乙酯揮干，然后真空干燥，得干膏，稱重，并用紫外分光光度法測總黃酮的含量。

2.1.6 醇提水沉法 取“2.1.1”中稀釋的水溶液500 ml，于4℃冰箱中放置12 h后，取出，濾過，取濾液減壓濃縮，真空干燥，得干膏，稱重，并用紫外分光光度法測總黃酮的含量。

2.1.7 醇提-水沉-醇沉法 取“2.1.1”中稀釋的水溶液500 ml，于4℃冰箱中放置12 h后，取出，濾過，取濾液減壓濃縮至25 ml，加乙醇使含醇量達70%，攪拌1 min，再于4℃冰箱中放置12 h后，取出，濾過，取濾液減壓濃縮，真空干燥，得干膏，稱重，并用紫外分光光度法測總黃酮的含量。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品6.33 mg，加乙醇制成每毫升含蘆丁0.2532 mg的溶液，即得。

2.2.2 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分別置25 ml量瓶中，各加水至6 ml，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，使混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑為空白，應用紫外-可見分光光度法，500 nm波長測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線[1]。

結果表明，蘆丁對照品在質(zhì)量為0.1266～1.5192 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關系（表1），得回歸方程為Y=0.3943X+0.0195，r=0.9999。

表1 蘆丁標準曲線的繪制

2.2.3 樣品含量測定結果 稱取各工藝制備的桑葉總黃酮1.0 g，置25 ml容量瓶中，加稀乙醇適量，超聲處理30 min，冷卻后加稀乙醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照標準曲線的制備項下的方法，自“加水至6 ml”起，依法測定吸光度，同時精密量取供試品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為空白溶液。從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的量，計算，即得（表2）。

表2 不同純化工藝制備的總黃酮收率和含量測定結果

2.2.4 準確度試驗 采用加樣回收法，取醇提-水沉-醇沉法所得樣品（含總黃酮18.5%），稱量6份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入蘆丁對照品溶液（0.092 89 g/ml）1 ml，分別按“2.2.3”方法操作，測定每份總黃酮含量（表3）。結果表明，回收率均在95%～105%內(nèi)，RSD=2.34%（<3%），符合方法學要求。

表3 準確度試驗的結果

3 討論

從不同純化工藝制備的桑葉總黃酮含量的測定結果分析，乙酸乙酯萃取法的純化效果較好，總黃酮含量最高，但是收率太低，說明大部分黃酮類化合物沒被保留下來，這樣的工藝和結果在實際生產(chǎn)上不可?。淮罂讟渲椒ǖ目傸S酮含量也較高，尤其是D101型和JD-1型大孔樹脂，可以使總黃酮含量達50%以上，但是收率較低，且生產(chǎn)工藝復雜，操作繁瑣，不符合工藝簡便廉價的要求；醇提-水沉-醇沉法，總黃酮含量符合15%以上的要求，收率高，工藝廉價簡便，因此更適于實際生產(chǎn)。

此外，本試驗還為生產(chǎn)上制備各種含量的桑葉總黃酮提供了一個參考，根據(jù)總黃酮的含量需求可選擇相應的純化工藝。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：279，372-373.

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[4] 賀偉強，向天勇，陶昆，等.響應面法優(yōu)化超聲輔助提取桑葉總黃酮的工藝研究[J].中國農(nóng)學通報，2012，28（33）：296-301.

[5] 勵建榮，韓曉祥.超高壓提取桑葉蘆丁[J].分析化學研究簡報，2008，36（3）：365-368.

[6] 蘭才.桑葉總黃酮提取工藝的優(yōu)選研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41（3）：1260，1280.

[7] 章華偉，陳星宇，凌春英.響應曲面優(yōu)化醇法提取桑葉黃酮工藝研究[J].氨基酸和生物資源，2010，34（3）：76-79.

[8] 薛淑萍，張立偉.正交實驗法純化桑葉中黃酮類化合物研究[J].山西師范大學學報，2011，25（2）：93-94.

[9] 朱欣婷.大孔樹脂純化桑葉總黃酮的工藝條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（26）：11397-11398，11405.

[10] 陳菁菁，李向榮，方曉.大孔吸附樹脂分離純化桑葉總黃酮及其動力學研究[J].浙江大學學報（醫(yī)學版），2006， 35（2）：219-223.

（收稿日期：2013-11-13 本文編輯：郭靜娟）

結果表明，蘆丁對照品在質(zhì)量為0.1266～1.5192 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關系（表1），得回歸方程為Y=0.3943X+0.0195，r=0.9999。

表1 蘆丁標準曲線的繪制

2.2.3 樣品含量測定結果 稱取各工藝制備的桑葉總黃酮1.0 g，置25 ml容量瓶中，加稀乙醇適量，超聲處理30 min，冷卻后加稀乙醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照標準曲線的制備項下的方法，自“加水至6 ml”起，依法測定吸光度，同時精密量取供試品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為空白溶液。從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的量，計算，即得（表2）。

表2 不同純化工藝制備的總黃酮收率和含量測定結果

2.2.4 準確度試驗 采用加樣回收法，取醇提-水沉-醇沉法所得樣品（含總黃酮18.5%），稱量6份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入蘆丁對照品溶液（0.092 89 g/ml）1 ml，分別按“2.2.3”方法操作，測定每份總黃酮含量（表3）。結果表明，回收率均在95%～105%內(nèi)，RSD=2.34%（<3%），符合方法學要求。

表3 準確度試驗的結果

3 討論

從不同純化工藝制備的桑葉總黃酮含量的測定結果分析，乙酸乙酯萃取法的純化效果較好，總黃酮含量最高，但是收率太低，說明大部分黃酮類化合物沒被保留下來，這樣的工藝和結果在實際生產(chǎn)上不可??；大孔樹脂吸附法的總黃酮含量也較高，尤其是D101型和JD-1型大孔樹脂，可以使總黃酮含量達50%以上，但是收率較低，且生產(chǎn)工藝復雜，操作繁瑣，不符合工藝簡便廉價的要求；醇提-水沉-醇沉法，總黃酮含量符合15%以上的要求，收率高，工藝廉價簡便，因此更適于實際生產(chǎn)。

此外，本試驗還為生產(chǎn)上制備各種含量的桑葉總黃酮提供了一個參考，根據(jù)總黃酮的含量需求可選擇相應的純化工藝。

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[8] 薛淑萍，張立偉.正交實驗法純化桑葉中黃酮類化合物研究[J].山西師范大學學報，2011，25（2）：93-94.

[9] 朱欣婷.大孔樹脂純化桑葉總黃酮的工藝條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（26）：11397-11398，11405.

[10] 陳菁菁，李向榮，方曉.大孔吸附樹脂分離純化桑葉總黃酮及其動力學研究[J].浙江大學學報（醫(yī)學版），2006， 35（2）：219-223.

（收稿日期：2013-11-13 本文編輯：郭靜娟）

結果表明，蘆丁對照品在質(zhì)量為0.1266～1.5192 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關系（表1），得回歸方程為Y=0.3943X+0.0195，r=0.9999。

表1 蘆丁標準曲線的繪制

2.2.3 樣品含量測定結果 稱取各工藝制備的桑葉總黃酮1.0 g，置25 ml容量瓶中，加稀乙醇適量，超聲處理30 min，冷卻后加稀乙醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照標準曲線的制備項下的方法，自“加水至6 ml”起，依法測定吸光度，同時精密量取供試品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為空白溶液。從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的量，計算，即得（表2）。

表2 不同純化工藝制備的總黃酮收率和含量測定結果

2.2.4 準確度試驗 采用加樣回收法，取醇提-水沉-醇沉法所得樣品（含總黃酮18.5%），稱量6份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入蘆丁對照品溶液（0.092 89 g/ml）1 ml，分別按“2.2.3”方法操作，測定每份總黃酮含量（表3）。結果表明，回收率均在95%～105%內(nèi)，RSD=2.34%（<3%），符合方法學要求。

表3 準確度試驗的結果

3 討論

從不同純化工藝制備的桑葉總黃酮含量的測定結果分析，乙酸乙酯萃取法的純化效果較好，總黃酮含量最高，但是收率太低，說明大部分黃酮類化合物沒被保留下來，這樣的工藝和結果在實際生產(chǎn)上不可??；大孔樹脂吸附法的總黃酮含量也較高，尤其是D101型和JD-1型大孔樹脂，可以使總黃酮含量達50%以上，但是收率較低，且生產(chǎn)工藝復雜，操作繁瑣，不符合工藝簡便廉價的要求；醇提-水沉-醇沉法，總黃酮含量符合15%以上的要求，收率高，工藝廉價簡便，因此更適于實際生產(chǎn)。

此外，本試驗還為生產(chǎn)上制備各種含量的桑葉總黃酮提供了一個參考，根據(jù)總黃酮的含量需求可選擇相應的純化工藝。

[參考文獻]

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[4] 賀偉強，向天勇，陶昆，等.響應面法優(yōu)化超聲輔助提取桑葉總黃酮的工藝研究[J].中國農(nóng)學通報，2012，28（33）：296-301.

[5] 勵建榮，韓曉祥.超高壓提取桑葉蘆丁[J].分析化學研究簡報，2008，36（3）：365-368.

[6] 蘭才.桑葉總黃酮提取工藝的優(yōu)選研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41（3）：1260，1280.

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[8] 薛淑萍，張立偉.正交實驗法純化桑葉中黃酮類化合物研究[J].山西師范大學學報，2011，25（2）：93-94.

[9] 朱欣婷.大孔樹脂純化桑葉總黃酮的工藝條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（26）：11397-11398，11405.

[10] 陳菁菁，李向榮，方曉.大孔吸附樹脂分離純化桑葉總黃酮及其動力學研究[J].浙江大學學報（醫(yī)學版），2006， 35（2）：219-223.

（收稿日期：2013-11-13 本文編輯：郭靜娟）