一貫煎治療二甲基亞硝胺致小鼠肝纖維化的機(jī)制研究

張 媛，朱 英

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 感染科，遼寧 大連116011)

肝硬化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積，伴隨肝細(xì)胞損傷、肝功能障礙、肝臟纖維化的慢性疾病。肝纖維化逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵在于肝內(nèi)異常增生的病理性結(jié)締組織的降解與損傷肝臟實質(zhì)細(xì)胞的再生。在肝纖維化發(fā)生和逆轉(zhuǎn)過程中有很多細(xì)胞因子發(fā)揮調(diào)控作用［1］。近年的大量研究表明，在抗肝臟纖維化的治療中，中藥方劑在綜合藥理治療作用方面有著獨特優(yōu)勢［2］。

本研究應(yīng)用二甲基亞硝胺(DMN)造成小鼠肝纖維化模型，觀察在造模及治療階段的小鼠肝功能的動態(tài)變化及應(yīng)用一貫煎治療后信號通路中相關(guān)蛋白表達(dá)情況，分析研究一貫煎在改善肝纖維化方面的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象

昆明小鼠205 只，雌雄不限，4 ～6 周齡，體重16 ～22 g，購于大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心［合格證書編號:SCXK(遼)2008 -0002］，于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室清潔級動物房飼養(yǎng)，自由飲食，飲自來水，環(huán)境溫度20 ～25 ℃，相對濕度60% ～80%。

1.2 主要試劑與設(shè)備

二甲基亞硝胺(Dimethylnitrosamine，DMN)為東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品:lot. MAL05。兔抗鼠SDF-1 (ab25117)、Phospho - NF - κB (p65)(ab16502)、Wnt -1(ab135610)、CXCR4(ab2074)、ERK1 + 2(ab17942)、β - catenin(ab32572)、α -SMA(ab66133)均為abcam 公司產(chǎn)品?？旖菪悦笜?biāo)羊抗鼠/兔LgG 聚合物、DAB 顯色盒，檸檬酸組織抗原修復(fù)液(100 ×)均為北京邁新公司產(chǎn)品。3%過氧化氫去離子水，為北京中杉金橋產(chǎn)品。OLYMPUS-AU2700 全自動生化分析儀配套試劑。一貫煎按照原方比例和制法制備(《柳洲醫(yī)話》北沙參9 g、麥冬9 g、當(dāng)歸9 g、生地18 g、枸杞9 g、川楝子5 g 共59 g)，大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房煎制，冷藏干燥，閉光保存。肝細(xì)胞生長因子注射液(威海賽洛金藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)WS1 -9(X -103)-2004Z，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20010003);OLYMPUS-AU2700 全自動生化分析儀。

1.3 肝纖維化模型制備及治療方法

參照J(rèn)enkins 等［3］介紹的方法制備DMN 肝纖維化模型。將205 只小鼠分為模型組185 只，正常對照組20 只，模型組按DMN 10 mg/kg 劑量腹腔注射，正常對照組腹腔注射同等量生理鹽水，每周連續(xù)3 d，1 次/d，共4 周。觀察小鼠一般狀況，于造模2 周及4 周處死模型組與正常對照組小鼠10 只檢測血清生化肝功、行肝組織HE 染色及免疫組化染色。

造模4 周后將模型組小鼠隨機(jī)分為一貫煎組、陽性對照組即HGF 組及空白組，一貫煎組按0.01 mL/g·d 藥物稀釋液灌胃給藥，HGF 組應(yīng)用HGF 200 μg/kg 皮下注射，空白治療組以同體積生理鹽水給予相應(yīng)處理，各組均1 次/d 給藥共4 周。各組于給藥2 周時分別處死20 只，給藥4 周時處死剩余小鼠，觀察及處理因素同前。

1.4 樣品的采集

小鼠麻醉后取血清，取1.0 cm ×0.8 cm ×0.3 cm 大小肝組織，10%中性福爾馬林液固定24 h 后逐級酒精脫水，二甲苯透明，56 ℃石蠟包埋，用于HE 染色及免疫組化染色檢測。

1.5 觀察項目與方法

1.5.1 一般狀況觀察:包括小鼠的死亡情況、體重、進(jìn)食、飲水、活動情況及毛發(fā)變化等。

1.5.2 肝功能檢測:ALT、AST、ALB、TBIL、DBIL、CHE、ALP、GGT。

1.5.3 肝組織肉眼及鏡下病理學(xué)改變:按文獻(xiàn)［4］肉眼觀察小鼠肝臟的外形、體積、顏色及質(zhì)地的改變，HE 染色顯微鏡下觀察肝組織切片的病理變化，重點觀察肝細(xì)胞變性、壞死及肝纖維化的程度(α -SMA 蛋白檢測)。

1.5.4 免疫組化檢測:肝組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、一抗二抗孵育、DAB 染色、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、脫水透明后做半定量免疫組化分析，依據(jù)Image pro plus 6.0 電腦分析輔助與自動測量程序圖像分析系統(tǒng)(Carl Zeiss)。

1.5.5 一貫煎對肝纖維化小鼠多種信號通路上相關(guān)蛋白的影響:肝組織SDF -1、Phospho -NF -κB(p65)、Wnt -1、CXCR4、ERK1 +2、β - catenin 分析，采用免疫組化法，分析方法同上。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0 分析數(shù)據(jù)計量資料，用ANOVA 程序進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD 程序進(jìn)行兩兩比較;多個樣本率的比較應(yīng)用行列表的卡方檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般情況比較

實驗過程中發(fā)現(xiàn)腹腔給藥注射DMN 后，小鼠表現(xiàn)焦躁，易激怒;注射藥物后約5 h 逐漸趨于平靜，活動減少，造模4 天后情況有所改善，在第7 天表現(xiàn)基本恢復(fù)正常。進(jìn)食量飲水量各組小鼠沒有明顯差別。實驗中均有死亡(各組死亡情況詳見表1)。模型組小鼠毛發(fā)稀疏，有脫落，活動量少，少量有腹水癥狀。一貫煎治療后上述癥狀有所改善，死亡率逐漸降低，且一貫煎組死亡率低于空白組(P =0.043，P ＜0.05)。

表1 各組小鼠死亡率Tab 2 Mortality of mice in each group

2.2 肝臟血清生化指標(biāo)比較

2.2.1 模型組與正常對照組血清生化比較:ALT 在造模第2 周有顯著性增高(P=0.048，P ＜0.05)，造模第4 周較造模第2 周增高不明顯(P =0.183，P ＞0.05);AST 在造模2 周增加不明顯(P =0.223，P ＞0.05)，在第4 周明顯增高(P=0.000，P ＜0.05)，且第4 周明顯高于第2 周(P =0.000，P ＜0.05);ALB在造模第2 周明顯降低(P=0.003，P ＜0.05)，并且隨著造模的進(jìn)行在第4 周ALB 明顯低于造模第2周(P=0.000，P ＜0.05);TBIL 在造模第2 周便有明顯增高(P=0.023，P ＜0.05)，造模第4 周較造模第2 周增高不明顯(P =0.991，P ＞0.05);DBIL 在造模第4 周有明顯升高(P=0.000，P ＜0.05)，且在造模第4 周明顯高于造模第2 周(P =0.002，P ＜0.05);CHE 在造模第4 周明顯降低(P=0.004，P ＜0.05)，第4 周較第2 周降低不明顯(P =0.057，P ＞0.05);ALP 在造模第4 周有明顯增高(P=0.014，P ＜0.05)，第4 周與第2 周變化無顯著性意義(P =0.09，P ＞0.05);GGT 在造模前后差異無顯著性意義(P ＞0.05)。見表2。

2.2.2 治療階段各組血清生化比較:與空白組比較，一貫煎組ALT 在第2 周明顯降低(P =0.000，P ＜0.05)，第4 周較第2 周無明顯降低(P =0.160，P ＞0.05);AST 在第2 周明顯降低(P =0.000，P ＜0.05)，第4 周較第2 周無明顯降低(P =0.080，P ＞0.05);ALB 在第2 周明顯增高(P = 0. 001，P ＜0.05)，第4 周較第2 周無明顯增高(P =0.066，P ＞0.05);CHE 在第2 周無明顯升高(P =0.181，P ＞0.05)，第4 周明顯升高(P=0.000，P ＜0.05)，且第4 周較第2 周增加(P=0.001，P ＜0.05);ALP 在第2 周無明顯降低(P =0.202，P ＞0.05)，第4 周時明顯降低(P =0.037，P ＜0.05);TBIL，DBIL，GGT 在治療前后差異無顯著性意義(P ＞0.05)。一貫煎組與HGF 組隨治療時間分別對比各指標(biāo)差異均無顯著性意義(P ＞0.05)。見表3。

表2 模型組及正常對照組血清肝功生化指標(biāo)Tab 2 Serum biochemical markers of liver function in model groups and control group

表3 空白組、一貫煎組及HGF 組血清肝功能生化指標(biāo)Tab 3 Serum biochemical markers of liver function in control group，Yiguanjian group and HGF group

2.3 肝組織病理學(xué)變化

2.3.1 肉眼觀察:正常對照組肝臟呈紅褐色，表面光滑質(zhì)軟;模型組肝臟明顯腫脹，色蒼黃，部分肝表面呈結(jié)節(jié)狀，質(zhì)硬，油膩。

一貫煎組與HGF 組部分肝臟輕度腫大，黃褐色，表面尚光滑，較模型組輕，尤以一貫煎組較明顯。

2.3.2 肝組織HE 染色變化:光鏡下正常對照組小鼠的肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞條索由中央靜脈向四周呈放射狀排列。匯管區(qū)可見極少量纖維結(jié)締組織，偶見成纖維細(xì)胞。造模2 周時少量肝細(xì)胞腫脹胞質(zhì)疏松，有較粗的纖維間隔向小葉伸展，肝竇充血擴(kuò)張。造模4 周時可見大面積出血性壞死并見大量腫脹的肝細(xì)胞，匯管區(qū)明顯增寬，大量淋巴細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞呈結(jié)節(jié)樣異常再生，有假小葉形成。

一貫煎組2 周肝細(xì)胞炎癥減輕，纖維間隔致密變細(xì)，假小葉較模型組4 周時減少，可見一貫煎組及HGF 組不完全纖維間隔，一貫煎組4 周與HGF 組4周肝組織炎癥明顯消退。見圖1。

圖1 肝組織HE 染色 (×200)Fig 1 HE staining of liver tissue

2.3.3 肝組織α-SMA 蛋白表達(dá)變化:DMN 造模4周后α-SMA 表達(dá)明顯多于正常對照組，主要集中在匯管區(qū)、纖維間隔及肝竇附近。一貫煎組2 周可見α-SMA 表達(dá)減少，一貫煎組4 周時α -SMA 表達(dá)明顯少于模型組4 周。見圖2。

圖2 肝組織α-SMA 免疫組化染色 (×200)Fig 2 Immunohistochemistry of α-SMA in liver tissue

2.4 肝纖維化小鼠信號通路相關(guān)蛋白變化

2.4.1 SDF -1 蛋白免疫組化表達(dá)變化:一貫煎組2 周表達(dá)多于空白組2 周(P =0.012，P ＜0.05)，一貫煎4 周表達(dá)多于空白組4 周(P = 0. 009，P ＜0.05)，一貫煎4 周表達(dá)顯著多于一貫煎2 周(P =0.008，P ＜0.05)，表達(dá)主要位于匯管區(qū)及肝竇附近的細(xì)胞間質(zhì)。見圖3。

2.4.2 CXCR4 蛋白免疫組化表達(dá)變化:一貫煎組2周表達(dá)顯著多于空白組2 周(P=0.031，P ＜0.05)，一貫煎4 周表達(dá)多于空白組4 周(P =0.028，P ＜0.05)，一貫煎4 周多于一貫煎組2 周(P =0.04，P ＜0.05)，表達(dá)主要位于匯管區(qū)及肝竇附近的細(xì)胞膜。見圖4。

圖3 肝組織SDF-1 免疫組化染色 (×400)Fig 3 Immunohistochemistry of SDF-1 in liver tissue

圖4 肝組織CXCR4 免疫組化染色 (×400)Fig 4 Immunohistochemistry of CXCR4 in liver tissue

2.4.3 Wnt-1 蛋白免疫組化表達(dá)變化:一貫煎組2 周表達(dá)少于空白組2 周(P =0.038，P ＜0.05)，一貫煎組4 周表達(dá)少于空白組4 周(P =0.022，P ＜0.05)，一貫煎4 周少于一貫煎2 周(P =0.029，P ＜0.05)，表達(dá)主要位于匯管區(qū)及肝竇附近的細(xì)胞間質(zhì)。見圖5。

圖5 肝組織Wnt-1 免疫組化染色 (×400)Fig 5 Immunohistochemistry of Wnt-1 in liver tissue

2.4.4 β-catenin 蛋白免疫組化表達(dá)變化:一貫煎組2 周表達(dá)較空白組2 周少(P =0.041，P ＜0.05)，且一貫煎組4 周較空白組4 周少(P =0.011，P ＜0.05)，一貫煎2 周與一貫煎4 周比較無顯著性差異(P=0.082，P ＞0.05)，主要位于匯管區(qū)及肝竇附近的細(xì)胞質(zhì)。見圖6。

圖6 肝組織β-catenin 免疫組化染色 (×400)Fig 6 Immunohistochemistry of β-catenin in liver tissue

2.4.5 NF-κB p65 蛋白免疫組化表達(dá)變化 空白組4 周陽性染色與空白組2 周比較差異有顯著性意義(P=0.39，P ＜0.05)，一貫煎組2 周表達(dá)少于空白組2 周(P=0.045，P ＜0.05)，一貫煎組4 周與空白組4 周比較差異有顯著性意義(P =0.012，P ＜0.05)，主要位于匯管區(qū)肝竇附近細(xì)胞質(zhì)。見圖7。

圖7 肝組織NF-κB p65 免疫組化染色 (×400)Fig 7 Immunohistochemistry of NF-κB p65 in liver tissue

2.4.6 ERK1 +2 蛋白免疫組化表達(dá)變化:一貫煎組2 周細(xì)胞質(zhì)陽性表達(dá)多于空白組2 周(P =0.045，P ＜0.05)，一貫煎組4 周細(xì)胞質(zhì)陽性表達(dá)多于空白組4 周(P=0.035，P ＜0.05)，一貫煎組4 周陽性染色明顯多于一貫煎組2 周(P =0.027，P ＜0.05)，主要位于匯管區(qū)肝竇附近細(xì)胞質(zhì)。見圖8。

圖8 肝組織ERK1 +2 免疫組化染色 (×400)Fig 8 Immunohistochemistry of ERK1 +2 in liver tissue

3 討 論

目前肝纖維化及早期肝硬化組織重構(gòu)成為現(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究的重要領(lǐng)域，現(xiàn)有研究顯示肝臟中有干細(xì)胞參與肝細(xì)胞再生及肝臟損傷修復(fù)，同時多種來源的干細(xì)胞有向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的跡象［5］，并且很多研究探討干細(xì)胞在肝損傷中作用機(jī)制。本課題組前期工作已經(jīng)證實，在肝硬化模型的進(jìn)展和逆轉(zhuǎn)過程中，存在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化［6］，因此本研究將進(jìn)一步探討一貫煎促進(jìn)干細(xì)胞肝向分化的作用機(jī)制。

一貫煎具備養(yǎng)陰功能可誘導(dǎo)肝臟卵圓細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，重塑損傷的肝臟組織，改善肝功能［7］。本研究中應(yīng)用一貫煎治療肝纖維化小鼠后，肝臟生化指標(biāo)ALB、CHE、ALP、GGT、TBIL、DBIL、ALT、AST均有不同程度改善，說明一貫煎具有改善肝纖維化后肝功能的作用。

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞及不成熟的成骨細(xì)胞分泌，是一種對免疫細(xì)胞具有趨化作用且分子量較小的趨化因子蛋白［8］。當(dāng)急性肝損傷后相關(guān)損傷部位的SDF-1 會分泌增加。CXCR4 是保守的7 次跨膜G 蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，廣泛表達(dá)于單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞及所有的CD34+細(xì)胞表面，SDF-1 是已知的唯一能與CXCR4 受體結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)的趨化因子［9］。本實驗中一貫煎組2 周后出現(xiàn)陽性表達(dá)，隨著治療的進(jìn)行SDF -1 及CXCR4 陽性表達(dá)增強(qiáng)，說明骨髓基質(zhì)細(xì)胞參與肝細(xì)胞再生、肝功能恢復(fù)活動，一貫煎能誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞參與肝細(xì)胞再生，參與肝纖維化。

經(jīng)典Wnt 信號通路僅在器官發(fā)育、胚胎軸分化和細(xì)胞再生等過程中短暫發(fā)揮作用，而其異常持續(xù)活動與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)［10］。經(jīng)典的Wnt 通路的傳導(dǎo)模式是:細(xì)胞外的Wnt 蛋白與細(xì)胞膜上的受體Frizzled/LRP 結(jié)合啟動Wnt 信號，抑制β-catenin 磷酸化。胞漿內(nèi)未被磷酸化的β -catenin 蛋白可逃逸被泛素化水解系統(tǒng)降解的命運，繼而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子共同作用，激活靶基因轉(zhuǎn)錄［11］。β-catenin 蛋白作為Wnt 通路的重要成員，其蛋白穩(wěn)定性和活性的調(diào)節(jié)是Wnt 通路中的關(guān)鍵事件之一，其在細(xì)胞內(nèi)的異常累積是Wnt 通路激活的標(biāo)志事件［12］。研究中一貫煎組及HGF 組在造模第4 周出現(xiàn)Wnt-1 及β-catenin 蛋白免疫組化陽性表達(dá)，值得進(jìn)一步研究有無肝纖維化后肝癌發(fā)生傾向［13］。隨著一貫煎治療進(jìn)行Wnt -1 及β -catenin蛋白陽性表達(dá)逐漸減弱，驗證了一貫煎在通過經(jīng)典Wnt 通路參與肝纖維化恢復(fù)，減少肝癌發(fā)生可能。

核因子κB (nuclear factor-κB，NF -κB)是一類轉(zhuǎn)錄因子，在體內(nèi)各種型細(xì)胞中普遍存在。NFκB 家族蛋白在經(jīng)典途徑中可由多種刺激如細(xì)菌、病毒以及多種細(xì)胞因子激活由胞質(zhì)進(jìn)入胞核經(jīng)典途徑中，在未受刺激時p65/p50 組成的異源二聚體由于結(jié)合了NF-κB 抑制蛋白α(IκBα)而不能入核，當(dāng)刺激發(fā)生后，NF -κB 能夠入核并在核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能［14］。近年來的研究表明應(yīng)用NF -κB 抑制劑后能有效地減慢肝纖維化進(jìn)程［15］。本研究中一貫煎組及HGF 組的NF-κB p65 免疫組化表達(dá)均低于空白治療組。說明一貫煎可以抑制NF -κB 活性，減少進(jìn)一步損傷肝臟，減慢肝纖維化進(jìn)程。

MAPK 在哺乳動物細(xì)胞中分為4 個亞族，即細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular - signal regulated protenin kinase，ERK)、c - Jun 氨基末端激酶(c -Jun amino-terminal kinase，JNK)、p38 和ERK5［16］。目前認(rèn)為，p38 和JNK 屬于“應(yīng)激誘導(dǎo)”的MAPK，而ERK 被認(rèn)為是與細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)化和分化相關(guān)的MAPK。ERK 是MAPK 家族的重要成員，包括兩種異構(gòu)體ERK1 及ERK2(分別為p44 和p42)。ERK級聯(lián)反應(yīng)包括典型的三個層次MAPKs 的序貫激活過程即MKKK (MAP kinase kinase kinase)→MAKK或MEK(MAP kinase kinase)→MAPK［17-18］。ERK激活對于Ras 誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子(如ELKL、cEts1 和cEts2)的激活以及激酶(如P90rskl、MNKI 和MNK2)的激活是至關(guān)重要的。本研究中ERK 蛋白在應(yīng)用一貫煎后陽性表達(dá)逐漸增加，說明在肝纖維化后有細(xì)胞增殖分化轉(zhuǎn)化的發(fā)生。有待進(jìn)一步證實參與細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞種類，明確一貫煎有無誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)細(xì)胞參與肝細(xì)胞修復(fù)。

本課題研究表明，一貫煎可通過調(diào)控上述信號通路的作用，誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，從而重構(gòu)損傷肝組織，改善肝功能，為進(jìn)一步應(yīng)用一貫煎治療肝纖維化的臨床研究建立基礎(chǔ)。然而本課題仍尚起步，有諸多不足，對于肝纖維化后新生肝臟細(xì)胞性質(zhì)、來源以及體外鑒定有待于進(jìn)一步研究。

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