四角蛤蜊醇沉上清液對CCl4致小鼠急性肝損傷保護(hù)作用

陸杰霖，劉秋風(fēng)，賈夢蛟，柴　堯，劉　睿，王欣之，吳　皓（南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210023）

四角蛤蜊醇沉上清液對CCl4致小鼠急性肝損傷保護(hù)作用

陸杰霖，劉秋風(fēng)，賈夢蛟，柴堯，劉睿，王欣之，吳皓*
（南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210023）

目的：研究四角蛤蜊醇沉上清液對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法：四氯化碳造成急性肝損傷模型，測定小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），還原性谷胱甘肽（GSH）活性；測定肝勻漿中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力，對肝組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。結(jié)果：醇沉上清液（MS）高、中、低劑量組具有明顯的劑量依賴性降低CCl4致小鼠肝損傷血清ALT，AST，GSH（p＜0.01），高、中劑量組降低肝勻漿中MDA的含量（p＜0.05），增強(qiáng)SOD的活性（p＜0.01）。通過病理學(xué)切片觀察，MS各劑量組能顯著改善肝組織的病理變化。結(jié)論：MS對CCl4造成的小鼠急性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用。

四角蛤蜊醇沉上清液，四氧化碳，保肝作用

四角蛤蜊（Mactra venerformis）為軟體動物門（Mollusca），隸屬于瓣鰓綱（Lamellibranchia）異齒亞綱（Helterodonta）簾蛤目（Veneroida）蛤蜊科（Mactride）的動物，是一種分布于我國南北各海區(qū)較大型的經(jīng)濟(jì)貝類[1]?，F(xiàn)代研究表明，四角蛤蜊具有較好的抗氧化活性，其活性較強(qiáng)部位在四角蛤蜊的水提醇沉上清液中[2]。課題組前期研究表明，四角蛤蜊醇沉上清液經(jīng)分析測定，含有核苷類[3]占上清液中總量為2%左右、總氨基酸占上清液中30%左右，上清液中還含有脂肪酸類及甾醇類等小分子。本文以腹腔注射四氯化碳的方法建立小鼠急性肝損傷模型，評價(jià)四角蛤蜊水提醇沉上清液的保肝活性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

四角蛤蜊江蘇省海洋水產(chǎn)研究所提供，批號：20100706，經(jīng)江蘇省海洋水產(chǎn)研究所萬夕和研究員鑒定為蛤蜊科動物四角蛤蜊（Mactra veneriformisReeve）的新鮮軟體部分；ICR小鼠18～22g，雄性，清潔級，南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生成許可證SCXK（蘇）2008-0004；聯(lián)苯雙脂北京協(xié)和藥廠，產(chǎn)品批號：12060105；四氯化碳成都市科龍化工試劑廠，批號：20120220，使用時(shí)用花生油配制成0.1%的花生油溶液，現(xiàn)配先用；氯化鈉注射液南京小營藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：12012110606；BCA蛋白測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）試劑盒均為南京建成生物工程研究所提供。

YP6002型電子天平上海光正醫(yī)療儀器有限公司；3-16PK型臺式高速冷凍離心機(jī)Sigma；XHF-P型高速分散器內(nèi)切式勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；80-2B型臺式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠制造；RT-6000型酶標(biāo)儀美國雷杜；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；Waters 2695液相色譜儀美國Waters公司；BP211D型電子分析天平德國Satrorius公司；KQ-250型超聲清洗器昆山超聲儀器有限公司；純水機(jī)美國Millipore公司；FA1104型電子分析天平上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2樣品制備

取新鮮四角蛤蜊軟體15kg，洗凈泥沙，瀝干后絞碎，放入多功能提取罐，加3倍量水，每次煮沸40min，煎煮3次，除去濾渣，合并濾液，得到四角蛤蜊總提液。將濾液濃縮至適量，14000r/min離心，取上清液，加入95%乙醇，使乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到65%，攪勻，靜置24h，抽濾，得沉淀和上清液。將沉淀用適量水復(fù)溶后加95%乙醇，使乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)75%，攪勻，靜置24h，合并兩次上清，加壓回收乙醇，得褐色的上清液浸膏，即得四角蛤蜊醇沉上清液（MS）。

1.3動物實(shí)驗(yàn)

1.3.1動物分組和造模方法取60只小鼠，隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為正常對照組，四氯化碳模型組，MS的低、中、高劑量組（250、500、1000mg/kg）及聯(lián)苯雙酯組（150mg/kg）。正常對照組和CCl4模型組給予等量的生理鹽水，給藥組連續(xù)灌胃7d，于末次給藥1h后，除正常組對照腹腔注射花生油20mL/kg外，其余各組均腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液20mL/kg。禁食（不禁水）16h后，所有小鼠眼眶放血取血后，分離血清，測定血清中ALT、AST及GSH的活性。取血后小鼠立即解剖，取一小塊肝組織，均取相同部位，用4%左右的福爾馬林溶液固定，進(jìn)行石蠟包埋切片。同時(shí)另取相同部位的一塊肝組織用生理鹽水制備成10%的肝勻漿，低溫離心后去上清液，用硫代巴比妥酸法測定肝勻漿上清液中MDA含量，用黃嘌呤氧化酶法測定勻漿上清液中SOD活力。

1.3.2生化指標(biāo)檢測賴氏法測定血清中ALT，AST活性，二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）法測定GSH，硫代巴比妥酸法測定肝勻漿上清液中MDA含量，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法測定肝勻漿上清液中的蛋白含量，黃嘌呤氧化酶法測定勻漿上清液中SOD活力。

1.3.3病理學(xué)檢查用4%左右的福爾馬林溶液固定肝組織，常規(guī)石蠟包埋切片（片厚4μm），進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化，檢查下列指標(biāo)：a.有無肝細(xì)胞脂變、水腫；b.有無肝細(xì)胞壞死；c.肝小葉內(nèi)有無炎細(xì)胞浸潤；d.門管區(qū)有無炎癥及纖維組織增生。

1.4數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1MS對急性肝損傷小鼠血清生化指標(biāo)的影響

CCl4模型組血清中ALT、AST、GSH的含量與正常對照組相比，均明顯升高（p＜0.01），見表1，說明本次實(shí)驗(yàn)動物模型造模成功。MS的低、中、高劑量組及陽性藥對照組組血清ALT、AST、GSH活性與模型組相比具有顯著性差異（p＜0.01），給藥組呈劑量依賴性。其中，高劑量組其保肝活性與陽性對照藥聯(lián)苯雙酯接近。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCl4誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞損傷，從形態(tài)學(xué)及血清中ALT、AST活性測定顯示，損傷組與空白對照組相比明顯升高，而經(jīng)過預(yù)期給藥四角蛤蜊醇沉上清液7d的給藥組血清中ALT、AST明顯下降（p＜0.01），且呈一定的劑量依賴性，證實(shí)四角蛤蜊醇沉上清液能減輕CCl4所致急性肝損傷。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸組成的天然小分子三肽，作為體內(nèi)的中藥保護(hù)因子，對保護(hù)生物膜及生物大分子免受自由基損傷起著極其重要的作用[4]，保護(hù)損傷的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中，模型損傷組GSH顯著的升高，而預(yù)防性給予四角蛤蜊醇沉上清液的給藥組，GSH均顯著性的降低，且如同ALT、AST一樣，呈劑量依賴性。

2.2MS對急性肝損傷小鼠肝勻漿上清液中MDA含量、SOD活性的影響

CCl4模型組小鼠肝勻漿上清液MDA含量顯著升高（p＜0.01），SOD活性顯著降低（p＜0.01），MS對MDA有較強(qiáng)的抑制作用，能提高SOD的活性。其中，MS的中、高劑量組與聯(lián)苯雙脂組肝勻漿上清液中的MDA含量及SOD活性與模型組比較具有顯著性差異（p＜0.05）。自由基是啟動脂質(zhì)過氧化的關(guān)鍵性的因素，當(dāng)自由基含量越高時(shí)，說明肝臟的損傷程度也是越嚴(yán)重的，SOD是超氧陰離子自由基的清除劑，可以抑制自由基啟動的脂質(zhì)過氧化；MDA會導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能和代謝發(fā)生改變，能使膜通透性增加，對機(jī)體造成損傷[5]。本實(shí)驗(yàn)表明，MS中、高劑量組可以顯著降低CCl4致急性肝損傷小鼠肝勻漿上清液中MDA含量的升高（p＜0.05），提高SOD的活性（p＜0.01），提示了四角蛤蜊醇沉上清液對肝臟的保護(hù)作用也許是通過抗自由基及抑制脂質(zhì)過氧化而發(fā)揮作用的。

表1　MS對急性肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響（±s，n=8）Table 1　Effect of MS on ALT,AST by liver damaged（±s，n=8）

表1　MS對急性肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響（±s，n=8）Table 1　Effect of MS on ALT,AST by liver damaged（±s，n=8）

注：與模型組相比，*：p<0.05，**：p<0.01；表2同。

組別　劑量（mg·kg-1）　ALT（U·L-1）　AST（U·L-1）　GSH（μmol·gprot-1）正常對照?。?4.87±10.38**　28.76±5.84**　67.83±22.81**模型組?。?51.72±20.35　59.10±4.44　98.48±18.36聯(lián)苯雙脂組　150　51.61±23.50**　27.60±3.96**　67.17±8.41**MS組250　85.36±29.97**　32.91±4.07**　69.35±11.25**500　71.54±26.58**　28.58±4,47**　64.78±14.81**1000　54.79±22.67**　27.10±3.52**　61.96±11.08**

表2　MS對急性肝損傷小鼠肝勻漿MDA，SOD的影響（±s，n=8）Table 2　Effect of MS on MDA,SOD and liver index by liver damaged（±s，n=8）

表2　MS對急性肝損傷小鼠肝勻漿MDA，SOD的影響（±s，n=8）Table 2　Effect of MS on MDA,SOD and liver index by liver damaged（±s，n=8）

SOD（U·mg prot-1）正常對照　－　2.79±0.58**　29.67±2.50**模型組?。?.17±1.16　26.24±2.61聯(lián)苯雙脂組　150　2.91±0.60*　29.91±2.58*組別　劑量（mg·kg-1）MDA（nmol·mg prot-1）MS組250　3.90±1.05　41.72±2.87**500　2.83±0.59*　44.37±3.40**1000　2.69±0.60*　52.00±3.70**

2.3MS對急性肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)的影響

病理切片結(jié)果表明，正常對照組小鼠肝臟肝小葉略呈六邊形，結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無變形、壞死，門管區(qū)無炎癥或纖維組織增生，小葉間動脈、小葉間靜脈和小葉間膽管無病變。本組每例小鼠的肝臟各個(gè)部位均未見明顯病變。CCl4模型組小鼠主要為氣球樣變，變形的肝細(xì)胞體積明顯增大，胞漿疏松、淡染，核結(jié)構(gòu)欠清，集聚成灶狀分布，氣球樣變的肝細(xì)胞灶內(nèi)或周圍少數(shù)肝細(xì)胞嗜酸性壞死，肝小葉和門管區(qū)見中度炎細(xì)胞浸潤。MS低劑量組病變程度明顯輕于模型組，與高劑量、中劑量組比較，病變略明顯，肝細(xì)胞未見明顯水腫、脂變或氣球樣變，4例小鼠有輕微或輕度嗜酸變性，變性的肝細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，胞漿深伊紅染，細(xì)胞核變??；中劑量組肝細(xì)胞病變程度明顯輕于模型組，病變程度較高劑量組略明顯，肝細(xì)胞有輕微水腫及輕微炎細(xì)胞浸潤；高劑量組肝細(xì)胞病變明顯輕于模型組，未見明顯變性，表明MS高劑量組在保護(hù)肝損傷作用方面最佳，見圖1。

3　結(jié)論

通過現(xiàn)代藥理研究手段初步證實(shí)了四角蛤蜊水提醇沉上清液具有保肝活性，符合了傳統(tǒng)中醫(yī)理論關(guān)于蛤蜊能解酒毒和潤五臟的認(rèn)識。本文研究可以初步判定核苷、氨基酸類是四角蛤蜊起保肝活性的物質(zhì)成分，為四角蛤蜊新藥或功能性產(chǎn)品的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

Experimental study on ethanol subsiding method from Mactra veneriformis on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride in mice

LU Jie-lin，LIU Qiu-feng，JIA Meng-jiao，CHAI Yao，LIU Rui，WANG Xin-zhi，WU Hao*
（Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Key Laboratory of Research and Development in Marine Bio-resource Pharmaceutics，Nanjing 210023，China）

Objective：The effect of ethanol subsiding method from Mactra veneriformis（MS）was studied by carbon tetrachloride（CCl4）-induced liver injury in mice.Methods：Blood tissue samples were collection.Evaluations were made for lipid peroxidation，enzyme activities and biochemical parameters.Pathological histology was also performed.Results：MS pretreatment reduced the serum aspartate aminotransferase（ALT），alanine aminotransferase（AST），andreducedglutathioneactivities.Bycontrast，MSpretreatmentreduced liver MDA content and increased liver tissue SOD.The CCl4-induced histopathological changes were also reduced by the MS pretreatment.Conclusion：MS could be proposed to protect the liver damage induced by CCl4.

ethanol subsiding method from Mactra veneriformis；CCl4；hepatoproteaction

圖1　各組小鼠肝組織染色（HE，200×）Fig.1　Mouse livers pathological photograhps（HE，200×）

TS254.1

A

1002-0306（2014）14-0356-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.070

2013－11－11*通訊聯(lián)系人

陸杰霖（1989-），女，碩士研究生，研究方向：海洋藥物。

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201305007）；國家863計(jì)劃（SS2013AA090303）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（ysxk-2010）。