滇重樓多糖不同提取方法的比較研究

周 濃，郭冬琴，汪開拓，張德全，蓬國(guó)輝，張春芹（.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶萬州404000；.大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理67000）

滇重樓多糖不同提取方法的比較研究

周 濃1，2，郭冬琴1，汪開拓1，張德全2，*，蓬國(guó)輝1，張春芹2
（1.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶萬州404000；2.大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理671000）

對(duì)滇重樓多糖的不同提取工藝進(jìn)行研究。探討料液比、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取工藝條件。結(jié)果表明：回流提取的最佳工藝條件為在95℃水浴條件下，以1∶60（g∶mL）的料液比，提取時(shí)間1h，提取3次，最優(yōu)工藝條件下多糖提取率可達(dá)18.72mg/g；熱水浸提的最佳工藝條件為在85℃水浴條件下，以1∶80（g∶mL）的料液比，提取1.5h，提取2次，最優(yōu)工藝條件下多糖提取率可達(dá)23.84mg/g；超聲波輔助提取的最佳工藝條件為在50℃水溫條件下，以1∶50（g∶mL）的料液比，提取1.5h，提取2次，最優(yōu)工藝條件下多糖提取率可達(dá)24.32mg/g。3種提取方法對(duì)滇重樓多糖提取率影響差異不顯著，但超聲波輔助提取較熱水浸提、回流提取具有能耗低的優(yōu)點(diǎn)。

滇重樓，多糖，正交實(shí)驗(yàn)，回流提取法，熱水浸提法，超聲波輔助提取法

滇重樓（Paris polyphylla Smith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.）為百合科重樓屬植物，被《中國(guó)藥典》收載為中藥材重樓的基原植物之一，其根莖中主要含甾體皂苷、黃酮類和多糖類活性成分，具有抗腫瘤、止血、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[1-2]。研究表明植物多糖具有抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫功能、保護(hù)心血管、降血壓、降血脂等作用，已有豬苓多糖、香菇多糖、靈芝多糖等應(yīng)用于臨床[3-5]。前期研究表明滇重樓多糖具有顯著的免疫增強(qiáng)作用，并測(cè)定了其含量[6]，對(duì)其提取工藝的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[7-9]，采用熱水回流提取法、熱水浸提法、超聲提取法提取滇重樓中多糖，以多糖的提取率為考察指標(biāo)，獲得最佳的提取工藝條件，為滇重樓多糖在食品、醫(yī)藥等行業(yè)的應(yīng)用提供依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-無水葡萄糖對(duì)照品 中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201205，供含量測(cè)定用；蒽酮、濃硫酸、無水乙醇、三氯甲烷、石油醚（60～90℃）、正丁醇 分析純；滇重樓樣品 2012年10月采集于云南省大理市花甸壩藥材場(chǎng)，并經(jīng)作者本人鑒定為百合科植物滇重樓Paris polyphylla var.yunnanensis的干燥根莖；水 蒸餾水。

UV-2450型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；CP225D型分析天平 德國(guó)Sartorius公司；SB-5200DTN型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；RV10 basic V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA集團(tuán)；TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DC-100型多功能粉碎機(jī)（功率700W，28000r/min） 浙江武義鼎藏日用金屬制品廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 滇重樓多糖提取工藝流程 滇重樓洗凈→烘干→粉碎（80目）→石油醚回流脫脂[8]→過濾→濾渣按一定比例加入蒸餾水→不同方法提取→過濾→減壓濃縮→80%乙醇醇沉過夜（靜置24h）[8]→離心（4000r/min，15min）、過濾→Savage法除蛋白[10]→80%乙醇醇沉過夜（靜置24h）[8]→過濾、沉淀加蒸餾水定容至50mL→UV檢測(cè)→計(jì)算提取率。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加雙蒸水制成每1mL含100μg的溶液，即得對(duì)照品貯備液。精密量取葡萄糖對(duì)照品貯備液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0mL，分別置于10mL具塞刻度試管中，各加蒸餾水補(bǔ)至2.0mL，置于冰水中再精密加蒽酮溶液6.0mL，搖勻，于100℃沸水浴顯色15min，冷卻至室溫后，定容至刻度，流水冷卻至室溫，以2.0mL蒸餾水按同樣顯色條件作為空白，在625nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）[11]。以葡萄糖檢測(cè)濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=0.0259，C-0.0051，r=0.9998。結(jié)果表明，葡萄糖對(duì)照品在5.05～25.25μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3 滇重樓多糖含量測(cè)定 精密量取供試品溶液0.5～2.0mL，置10mL具塞刻度試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“各加蒸餾水補(bǔ)至2.0mL”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中多糖的濃度，計(jì)算公式如下[12]：多糖的提取率（%）=多糖的濃度（g/mL）×溶液體積（mL）×稀釋倍數(shù)/原料質(zhì)量（g）×10-6×100，即得。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以料液比、時(shí)間、溫度、提取次數(shù)為考察因素，設(shè)計(jì)L（934）正交實(shí)驗(yàn)來確定回流提取法（表1）、熱水浸提法（表2）、超聲波輔助提取法（表3）提取滇重樓多糖的最佳提取工藝。

表1 回流提取法正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test by the reflux extraction

表2 熱水浸提法正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal test by the hot water extraction

表3 超聲輔助提取法正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels table of orthogonal test by the ultrasonic assisted extraction

2 結(jié)果與分析

2.1 回流提取法提取滇重樓多糖工藝的研究

單因素實(shí)驗(yàn)確定回流提取法提取滇重樓多糖的適宜條件為：料液比1∶60，提取時(shí)間1h，提取溫度95℃，提取次數(shù)2次，在此基礎(chǔ)上以提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4、表5。

由表4的正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果可知，在考察的4個(gè)影響因素中，影響滇重樓多糖提取的主次順序依次為：提取溫度＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞料液比；由表5的進(jìn)一步方差分析得知，提取溫度對(duì)滇重樓多糖得率的影響最大，達(dá)顯著水平，其他3個(gè)因素水平對(duì)滇重樓多糖得率均有一定影響，差異未達(dá)到顯著水平。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，滇重樓多糖提取的最優(yōu)組合為A2B2C3D3，即以1∶60的料液比，在95℃水浴條件下，提取3次，每次提取1h。

表4 回流提取法提取滇重樓多糖正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Orthogonal experimental design and results of extracting polysaccharide from Paris polyphylla var.yunnanensis by the reflux extraction

表5 回流提取法正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 5 Analysis of variance（ANOVA）of the orthogonal experiment for the reflux extraction

2.2 熱水浸提法提取滇重樓多糖工藝的研究

單因素實(shí)驗(yàn)確定熱水浸提法提取滇重樓多糖的適宜條件為：料液比1∶60，提取時(shí)間1.5h，提取溫度85℃，提取次數(shù)2次，在此基礎(chǔ)上以提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表6、表7。

表7 熱水浸提法正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 7 Analysis of variance（ANOVA）of the orthogonal experiment for the hot water extraction

由表6的正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果可知，在考察的4個(gè)影響因素中，影響滇重樓多糖提取的主次順序依次為：浸提時(shí)間＞料液比＞浸提次數(shù)＞浸提溫度；由表7的進(jìn)一步方差分析得知，浸提時(shí)間和料液比對(duì)滇重樓多糖得率的影響最大，達(dá)顯著水平，而浸提次數(shù)對(duì)滇重樓多糖得率影響較小、浸提溫度對(duì)滇重樓多糖得率影響最小，差異均未達(dá)到顯著水平。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，滇重樓多糖提取的最優(yōu)組合為A3B2C2D2，即以1∶80的料液比，在85℃水浴條件下，提取2次，每次提取1.5h。

2.3 超聲波輔助提取法提取滇重樓多糖工藝的研究

單因素實(shí)驗(yàn)確定超聲波輔助（超聲功率300W，工作頻率40KHz）提取法提取滇重樓多糖的適宜條件為：料液比1∶20，超聲時(shí)間1h，提取溫度50℃，超聲次數(shù)2次，在此基礎(chǔ)上以提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表8、表9。

表8 超聲波輔助提取法提取滇重樓多糖正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 8 Orthogonal experimental design and results of extracting polysaccharide from P.polyphylla var.yunnanensis by the ultrasonic assisted extraction

表9 超聲波輔助提取法正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 9 Analysis of variance（ANOVA）of the orthogonal experiment for the ultrasonic assisted extraction

由表8的正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果可知，在考察的4個(gè)影響因素中，影響滇重樓多糖提取的主次順序依次為：超聲溫度＞料液比＞超聲時(shí)間＞提取次數(shù)；由表9的進(jìn)一步方差分析得知，超聲溫度、料液比、超聲時(shí)間對(duì)滇重樓多糖得率的影響最大，達(dá)顯著水平，而提取次數(shù)對(duì)滇重樓多糖得率影響最小，差異未達(dá)到顯著水平。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，滇重樓多糖提取的最優(yōu)組合為A2B3C2D2，即以1∶50的料液比，在50℃水溫條件下，提取2次，每次提取1.5h。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由于回歸正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳提取工藝條件并不在正交實(shí)驗(yàn)表安排的實(shí)驗(yàn)中，需進(jìn)一步做驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，不同提取方法所得滇重樓多糖提取率見表10。結(jié)果表明，從滇重樓多糖得率、經(jīng)濟(jì)等方面考慮，超聲波輔助提取法可明顯降低提取能耗、節(jié)約試劑，占有一定優(yōu)勢(shì)。至于滇重樓多糖的各組分、單糖含量、分子量及生理活性等還有待進(jìn)一步的研究。

表10 不同方法提取滇重樓多糖的比較（n=3）Table 10 Comparison among different methods of extracting polysaccharide from P.polyphylla var.yunnanensis（n=3）

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)比較了3種不同提取方法，從測(cè)定的滇重樓多糖含量來看，差異性不顯著。運(yùn)用回流提取法需要綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本，同時(shí)其提取率較低。該法所得工藝的最優(yōu)組合是在95℃水浴條件下，以料液比1∶60（g∶mL），提取時(shí)間1h，提取3次，滇重樓多糖的平均提取率為18.72mg/g。熱水浸提法是最能進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)所用方法之一，實(shí)驗(yàn)所得工藝參數(shù)為在85℃水浴條件下，以1∶80（g∶mL）的料液比，提取2次，每次提取1.5h。滇重樓多糖提取率為23.84mg/g，且成本較低、操作方便，適宜于工產(chǎn)化生產(chǎn)。超聲波輔助提取法的最優(yōu)工藝參數(shù)為在50℃水溫條件下，以1∶50（g∶mL）的料液比，提取2次，每次提取1.5h，滇重樓多糖的平均提取率為24.32mg/g，該法具有提取率高和適合于滇重樓多糖含量測(cè)定的樣品前處理方法，可作為實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究的首選方法之一。綜上所述，不同的提取工藝各具優(yōu)勢(shì)，在今后的研究和生產(chǎn)中可根據(jù)具體條件選擇合適提取工藝進(jìn)行。

本實(shí)驗(yàn)建立的3種提取工藝穩(wěn)定可靠，定量分析方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為滇重樓多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)性技術(shù)資料，為滇重樓的精深加工提供技術(shù)支撐。

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Comparative studies on different extraction process of polysaccharide from Paris polyphylla var.yunnanensis

ZHOU Nong1，2，GUO Dong-qin1，WANG Kai-tuo1，ZHANG De-quan2，*，PENG Guo-hui1，ZHANG Chun-qin2
（1.College of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000，China；2.College of Pharmacy，Dali University，Dali 671000，China）

Various extraction process of polysaccharide from Paris polyphylla var.yunnanensis was studied. Effect of the ratio of material to liquid，extraction time，extraction temperature and extraction times on extract rate of polysaccharide was studied.The best extraction process was determined by orthogonal experiment in case of the single factor condition.As a result，the best extraction process for reflux extraction method was to extract 3 times（1h/times）with the ratio of material to liquid for 1∶60（g∶mL）in 95℃water bath，and extraction rate of polysaccharide reached 18.72mg/g under the best condition.The best process for the hot water extraction method was to extract 2 times（1.5h/times）with the ratio of material to liquid for 1∶80（g∶mL）in 85℃water bath，and extraction rate of polysaccharide reached 23.84mg/g under the best condition.The best process for the ultrasonic assisted extraction method was to extract 2 times（1.5h/times）with the ratio of material to liquid for 1∶50（g∶mL）in 50℃water bath，and extraction rate of polysaccharide reached 24.32mg/g under the best condition.There was no significant difference among the three extraction methods to extraction efficiency of polysaccharide in P.polyphylla var.yunnanensis.

Parispolyphyllavar.yunnanensis；polysaccharide；orthogonaltest；refluxextraction；hotwaterextraction；ultrasonic assisted extraction

TS201.1

B

1002-0306（2014）14-0326-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.063

2013－10－09 *通訊聯(lián)系人

周濃（1978-），男，副教授，主要從事藥用植物栽培與質(zhì)量控制方面的研究。

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助（KJ131109）；萬州區(qū)科委自然科學(xué)基金項(xiàng)目（201301024）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260622）；重慶三峽學(xué)院科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃（201302）。