響應(yīng)曲面法優(yōu)化三七根多酚的提取工藝

朱素英（菏澤學(xué)院生命科學(xué)系，山東菏澤274015）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化三七根多酚的提取工藝

朱素英
（菏澤學(xué)院生命科學(xué)系，山東菏澤274015）

目的：為探明三七根多酚的優(yōu)化提取工藝。方法：在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時間、乙醇濃度三因素，用Design Expert軟件采用響應(yīng)曲面的Box-Behnken設(shè)計進(jìn)行實驗設(shè)計和分析，得到三因素以及之間的交互作用對三七根多酚得率影響的多元回歸模型、響應(yīng)曲面圖及等高線圖。結(jié)果：三七多酚提取的最佳條件為：乙醇濃度62%、溫度58℃、提取時間45min、多酚得率36.924mgGAE/g。結(jié)論：在最佳條件下三七根多酚得率的實驗值達(dá)到預(yù)測值的98.35%，說明結(jié)果可靠，可做為三七根多酚的提取最優(yōu)條件。

三七根，多酚，響應(yīng)曲面，提取工藝

三七（Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen），又名田七、金不換、南國神草等，三七隸屬五加科人參屬，三七根為我國名貴傳統(tǒng)藥材[1]，具有止血、滋補(bǔ)、增強(qiáng)免疫力等功效[2]，同時三七根亦廣泛應(yīng)用于烹飪、保健品行業(yè)。多酚在植物中廣泛分布，具有較強(qiáng)的清除自由基[2]、抗氧化活性[3]、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抗腫瘤以及預(yù)防神經(jīng)退行性疾病等[4]的能力，前期研究表明[5]，三七含有豐富的多酚類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的清除自由基的能力。但對于三七多酚提取工藝優(yōu)化尚未見報道。響應(yīng)曲面法（Response surface methodology，RSM）能夠評價各提取因素對化學(xué)物質(zhì)提取量的影響，以及各因素間相互關(guān)系[6]。RSM實驗周期短，回歸方程的精度高，并能同時研究幾種因素間的交互作用等[7-8]。目前，RSM已成功應(yīng)用于多酚等天然化合物的提取[9-10]，如藍(lán)莓渣[11]、南瓜果肉[12]等多種植物多酚的提取。本工作擬在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法對三七多酚進(jìn)行提取優(yōu)化，考察不同提取條件對多酚提取率的影響，以期為三七進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三七根 購于菏澤青年藥店，經(jīng)菏澤學(xué)院植物學(xué)教研室鑒定為三七（Panax notoginseng（Burk）F.H. Chen）的三年生干燥根；Folin-Ciocalteu試劑 上海荔達(dá)有限公司；沒食子酸、甲醇等 均為分析純。

TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DZF-6050型真空干燥箱 上海博訊實業(yè)公司；FW-100型高速萬能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 三七根多酚提取流程 稱取三七根40g，粉碎過40目篩，真空干燥箱中干燥至恒重，取1g粉末，置于三角燒瓶中，保鮮膜封口，置于水浴鍋中，按照實驗設(shè)計條件進(jìn)行提取，提取重復(fù)兩次合并三次提取液，得總多酚提取液，定容至30mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多酚含量的測定 多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[13]，取1mL提取液，加入5mL的稀釋10倍福林酚，搖勻，反應(yīng)5min，再加入4mL的7.5%Na2CO3，定容至10mL，搖勻，在室溫下放置60min，765nm測定吸光值，先以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)物，制作多酚回歸曲線：y=8.0213x+0.047；R2=0.9961，y為吸光度，x為沒食子酸濃度（mg/g），線性關(guān)系良好，根據(jù)回歸方程，和測定的多酚吸光度，計算出三七根提取液多酚的沒食子酸當(dāng)量濃度（mgGAE/g）。

三七根多酚的得率（mgGAE/g）=（多酚濃度×提取液定容后體積）/三七根粉末干質(zhì)量

1.2.3 單因素實驗及響應(yīng)曲面設(shè)計 選取單因素：提取溶劑（醇、乙醇、水；固定條件：料液比1∶10、溫度80℃、時間60min）；乙醇濃度（10%、30%、50%、70%、90%；固定條件：料液比1∶10、溫度80℃、時間60min）；提取溫度（20、40、60、80、100℃；固定條件：料液比1∶10、時間60min、乙醇濃度70%）；提取時間（15、30、45、60、75min；固定條件：料液比1∶10、溫度80℃、乙醇濃度70%）；進(jìn)行三七根多酚的提取，考察其對三七根多酚提取率的影響。

在單因素實驗結(jié)果上，使用Design Expert軟件采用響應(yīng)曲面的Box-Behnken實驗設(shè)計，選取乙醇濃度、提取溫度、提取時間三個因素作為自變量，多酚得率為響應(yīng)值（因變量），實驗設(shè)計的因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計的因素與水平Table 1 The factors and the leves for Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同的提取溶劑對多酚得率的影響

圖1 不同提取溶劑對多酚得率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on the extraction rate of polyphenols from the root of Panax notoginseng

植物各種成分的提取受提取溶劑影響較大，當(dāng)提取溶劑與提取成分極性相似時，成分就可以很好的被提取出來[14]。根據(jù)三七在日常生活中常用熱水蒸煮方式食用，以及在酚類提取過程中常用的甲醇、乙醇。因此選用甲醇、乙醇、水三種溶劑。結(jié)果如圖1所示，乙醇、甲醇提取率較高，最低的是水，結(jié)果與雪蓮果多酚的提取類似[15]。且在p＜0.05水平差異顯著。因乙醇安全性好，價格便宜，因此選擇乙醇作為進(jìn)一步實驗的溶劑。

2.2 不同的乙醇濃度對多酚得率的影響

圖2 不同乙醇濃度對三七根多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of polyphenols from the root of Panax notoginseng

在乙醇中加入一定比例的水可以提高植物有效成分的提取率[16]，因此選用一定濃度的乙醇作為提取的溶劑。結(jié)果如圖2所示，隨著乙醇濃度的從10%增至70%，多酚得率從17.36mgGAE/g逐漸增加到36.42mg/g達(dá)到最大；乙醇濃度從70%增加到90%，多酚得率又有所降低。在乙醇濃度過低時，水含量高，在植物體內(nèi)酚類常與多糖、蛋白質(zhì)質(zhì)等以氫鍵和疏水鍵形成穩(wěn)定的復(fù)合物。水對氫鍵的斷裂作用較弱，不足以破壞樣品中多酚類物質(zhì)與蛋白、多糖或其他物質(zhì)的鍵，多酚得率低[17]；乙醇濃度過高時，脂溶性成分被溶出較多，不利于多酚的提取[18]。因此選擇70%乙醇作為響應(yīng)曲面因素的中心點。

2.3 不同提取溫度對多酚提取率的影響

圖3 不同提取溫度對三七根多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polyphenols from the root of Panax notoginseng

如圖3所示，提取溫度對三七根提取率影響較大，多酚的得率隨著溫度的增高而增加，60℃時提取率達(dá)到最大34.86mgGAE/g，但當(dāng)溫度繼續(xù)增加，多酚得率卻略有下降。當(dāng)溫度增加，可以提高多酚溶質(zhì)的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)，多酚得率增大[19]；當(dāng)溫度過高時，會造成多酚一定程度的降解，多酚得率下降。因此選擇提取溫度60℃。

2.4 提取時間對多酚得率的影響

圖4 不同提取時間對三七根多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of polyphenols from the root of Panax notoginseng

結(jié)果如圖4所示，在15～45min范圍內(nèi)隨著提取時間增加三七根多酚得率增加速率較快，說明三七多酚溶出需要一定的時間，45min達(dá)到最大，提取時間繼續(xù)增加，多酚得率變化不大，說明45min多酚基本完全溶出。說明45min可作為三七多酚的最佳提取時間點。

2.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化多酚的提取

采用design-expert軟件，三七根多酚提取的Box-Behnken設(shè)計實驗結(jié)果如表2。

表2 三七根多酚提取的Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and result for the extraction of polyphenols the root of Panax notoginseng

2.5.1 建立回歸模型 分析表2中數(shù)據(jù)用designexpert軟件進(jìn)行多元回歸，模型如下：

Y=37.16-1.37A-2.11B+0.55C-2.65AB+1.39AC-1.94BC-1.40A2-5.51B2-7.41C2。

對該模型進(jìn)行顯著性分析結(jié)果如表3所示。可以看出回歸模型的p＜0.01達(dá)到極顯著水平，失擬項p＞0.05說明失擬項不顯著，殘差由隨機(jī)誤差引起，該回歸模型擬合度較好。相關(guān)系數(shù)R2=0.9904，說明99.04%的響應(yīng)值是由變量引起，說明此模型的相關(guān)性較好。校正決定系數(shù)R2Adj=0.9779說明有97.79%數(shù)據(jù)的變異性可以用此模型解釋。綜合上述分析可以以該方程代替實際值進(jìn)行優(yōu)化。

表3 二次回歸的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.5.2 各因素的交互作用 其極值處于等高線的圓心處，等高線越扁說明兩因素的交互作用對提取率的影響越大。從圖5和表3可以看出A、B、AB、BC、A2、B2、C2對提取率的影響較大，達(dá)到極顯著p＜0.001，其次是AC，達(dá)到顯著p＜0.05，C影響不顯著。將不顯著因素剔除，多元回歸方程優(yōu)化結(jié)果為：

Y=37.16-1.37A-2.11B-2.65AB+1.39AC-1.94BC-1.40A2-5.51B2-7.41C2。

由圖5和表3可知，各因素對多酚得率的影響大小依次為：提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間，交互效應(yīng)對提取率的影響：AB＞BC＞AC，且影響顯著。

優(yōu)化后的最佳提取條件：乙醇濃度62.30%、溫度57.96℃、提取時間45.22min、多酚得率37.5418mgGAE/g。為便于優(yōu)化條件在實際應(yīng)用中操作可行，優(yōu)化條件調(diào)整為：乙醇濃度62%、溫度58℃、提取時間45min，并在該實驗條件進(jìn)行，進(jìn)行驗證實驗，重復(fù)三次，得多酚得率36.924mgGAE/g，高達(dá)預(yù)測值的98.35%，說明該優(yōu)化條件結(jié)果較為可靠。

3 結(jié)論

采用Box-Behnken設(shè)計與響應(yīng)曲面法，建立了三七多酚提取率與三因素（提取溫度、提取時間、乙醇濃度）之間的二次項模型，根據(jù)該模型確定三七多酚提取的最佳條件為：乙醇濃度62%、溫度58℃、提取時間45min、多酚得率36.924mgGAE/g，對該條件進(jìn)行驗證得到很好的實驗結(jié)果，說明在對三七多酚的提取中，利用響應(yīng)曲面法進(jìn)行優(yōu)化，實驗步驟少、方法簡單經(jīng)濟(jì)，可以在三七多酚的提取中進(jìn)行推廣應(yīng)用。

圖5 兩因素（AB、AC、BC）之間交互作用對三七多酚得率的影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface for the effects of two factors（AB、AC、BC）on the extraction rate of polyphenols from the root of Panax notoginseng

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Optimization of polyphenol extraction from Panax notoginseng roots using response surface methodology

ZHU Su-ying
（Department of Life Science，Heze University，Heze 274015，China）

Objective：To predict optimum conditions of polyphenol extraction from Panax notoginseng roots. Methods：Box-Behnken design was used to experimental design and analyze on the basis of single-factor experiments.Effect of ethanol concentration，extraction time，extraction temperature and their cross-interaction on the extraction rate of polyphenols were researched，and multiple regression model，the response surface plot and contour plots was established.Results：Optimum conditions of polyphenol extraction were ethanol concentration 62%，extraction temperature 58℃，extraction time 45min and the extraction rate of polyphenols reached 36.924mgGAE/g.Conclusion：At the optimal processing conditions，the actual extraction rate can reach predicted extraction rate 98.35%.Thus optimum conditions were reliable and that could be used for polyphenol extraction from Panax notoginseng roots.

Panax notoginseng roots；polyphenol；response surface methodology；extraction

TS201.1

B

1002-0306（2014）14-0278-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.053

2013－10－08

朱素英（1980-），女，碩士研究生，講師，研究方向：中草藥的活性成分提取與利用。

山東省“十二五”高等學(xué)校重點實驗室。