乳酸乳球菌的高密度發(fā)酵研究

馮慧杰，沐萬孟，張 濤，江 波（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

乳酸乳球菌的高密度發(fā)酵研究

馮慧杰，沐萬孟，張 濤，江 波*
（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

為了提高一株乳酸乳球菌（Lactococcus lactisSYFS 1.009）單位體積活菌數(shù)，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)對培養(yǎng)基中各組分進(jìn)行了研究，并在此基礎(chǔ)上，利用3L發(fā)酵罐進(jìn)行恒pH補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，優(yōu)化后確定最優(yōu)的培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30g/L，酵母膏40g/L，磷酸二氫鉀40g/L，MgSO40.6g/L，MnSO4·H2O 0.1g/L，吐溫80 0.5mL/L。此條件下，30℃發(fā)酵14h后菌體干重為3.1g/L，是MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的3.4倍（菌體濃度0.9g/L）。在發(fā)酵罐恒pH補(bǔ)料12h后，發(fā)酵液OD600達(dá)到15.3，菌體干重為7.3g/L。

乳酸乳球菌，磷酸二氫鉀，乳酸

乳酸乳球菌作為一種益生菌，是乳制品發(fā)酵工業(yè)中重要的發(fā)酵劑，同時(shí)也可生產(chǎn)乳酸鏈球菌素（nisin），胞外多糖，γ-氨基丁酸，乳酸等。另外作為GRAS（Generally Regard as Safe）菌株，乳酸乳球菌也常被用作基因工程的受體菌。由于乳酸乳球菌的細(xì)胞數(shù)量是決定發(fā)酵劑性能和提高產(chǎn)物產(chǎn)量（在確保單位細(xì)胞酶活不變的前提下）的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因而乳酸乳球菌的高密度培養(yǎng)顯得十分重要。在乳酸菌高密度發(fā)酵方法的研究中，國內(nèi)研究者對緩沖鹽法和化學(xué)中和法研究較多，但最終獲得菌體濃度較小，一般不超過4g/L[1]。國外研究者還應(yīng)用透析法和細(xì)胞循環(huán)法培養(yǎng)乳酸菌。Osborne在1977年首次將透析應(yīng)用到乳酸桿菌培養(yǎng)中，獲得了30～40g/L的細(xì)胞干重[2]。TAKAHIRO SUZUKI用陶瓷濾器去除乳酸的方法，經(jīng)238h獲得細(xì)胞干重高達(dá)141g/L[3]。雖然透析法和細(xì)胞循環(huán)法比緩沖鹽法和化學(xué)中和法菌體密度有很大提高，但是需要對發(fā)酵罐做重大的技術(shù)改造且有膜污染等問題，不利于工業(yè)化推廣。

本實(shí)驗(yàn)所采用菌株是實(shí)驗(yàn)室保藏的一株乳酸乳球菌（Lactococcus lactisSYFS1.009）。本文根據(jù)乳酸乳球菌的生長特性，在考察碳氮源等因素的基礎(chǔ)上，著重對緩沖鹽體系及發(fā)酵罐恒pH補(bǔ)料操作進(jìn)行了探索，為后續(xù)該乳酸乳球菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)相應(yīng)產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸乳球菌（Lactococcus lactisSYFS1.009） 由實(shí)驗(yàn)室保藏；葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、乳糖、蔗糖、麥芽糖、硫酸銨、硝酸銨、吐溫80、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O等 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳酸 色譜純，Sigma公司。

CL-40M型全自動(dòng)蒸汽滅菌鍋 日本ALP公司；Centrifuge 5804R型離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Alpha-1系列紫外可見分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司；pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海恒科有限公司；SW-CJIFD型超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限制造公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；B1-150A型低溫生化培養(yǎng)箱 施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；BIOFLO-110型3L發(fā)酵罐 美國NBS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 MRS液體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏5，牛肉膏10，蛋白胨10，K2HPO42，乙酸鈉5，檸檬酸氫二銨2，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，吐溫80 1mL，pH6.8～7.0。斜面培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加20g/L瓊脂。

1.2.2 菌種制備與傳代 將乳酸乳球菌保藏菌種轉(zhuǎn)接于斜面試管中，30℃下培養(yǎng)24h，4℃保存。從保藏的斜面試管培養(yǎng)基中挑取菌落于裝有100mL MRS液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃靜置培養(yǎng)24h，傳代2～3次進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 發(fā)酵條件 三角瓶發(fā)酵條件：250mL三角瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基100mL，調(diào)初始pH為6.8～7.0，種子接種量為1%，30℃靜置培養(yǎng)14h后測定OD600。3L發(fā)酵罐發(fā)酵條件：裝液量為2L，接種量為1%，30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為50r/min，不通氣。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 不同碳源對菌體密度的影響 分別采用2%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、果糖作為不同的碳源，其他培養(yǎng)基成分參照1.2.1中MRS培養(yǎng)基組成添加，進(jìn)行三角瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以發(fā)酵液OD600為依據(jù)優(yōu)化碳源。

1.2.4.2 不同氮源對菌體密度的影響 分別采用2.5%的蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨，硫酸銨、硝酸銨、0.5%酵母膏+1%牛肉膏+1%蛋白胨、0.83%酵母膏+0.83%胰蛋白胨+0.83%蛋白胨作為不同的氮源，碳源種類為1.2.4.1中選定碳源，其他成分參照1.2.1中培養(yǎng)基組成添加，進(jìn)行三角瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以發(fā)酵液OD600為依據(jù)優(yōu)化氮源。

1.2.4.3 緩沖鹽體系的篩選及濃度的確定 分別向培養(yǎng)基中添加濃度為0.05～0.45mol/L的pH為7的各緩沖體系，分別是磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉；磷酸二氫鉀/氫氧化鈉；磷酸氫二鈉/檸檬酸；磷酸氫二鈉/磷酸二氫鉀；檬酸鈉/乙酸鈉/磷酸氫二鉀；磷酸氫二鉀/乙酸鈉/檸檬酸氫二銨，氮源為25g/L酵母膏，其他成分與MRS培養(yǎng)基相同，測定OD600來挑選合適的緩沖鹽體系。

1.2.4.4 碳氮源總量及碳氮比的篩選 在緩沖鹽實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別用5%～9%的碳氮總量與0.25～2的碳氮比組合取代原培養(yǎng)基中碳、氮源，其他成分與MRS培養(yǎng)基相同，接種發(fā)酵，根據(jù)菌體生長情況來確定適宜的碳氮量。

1.2.4.5 微量元素、吐溫80對菌體生物量的影響 以30g/L葡萄糖，40g/L酵母膏，40g/L磷酸二氫鉀為培養(yǎng)基主要成分，其他成分參照MRS培養(yǎng)基。按濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、0.7、1、2g/L添加MnSO4·H2O，按濃度為0.1、0.25、0.5、0.7、1、2、3、5g/L添加MgSO4，按濃度為0.02、0.05、0.07、0.1、0.2、0.5g/L添加CuSO4，按濃度為0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、1、1.5、2、5g/L添加FeSO4·7H2O，按濃度為0.5、1、2、4、8mL/L添加吐溫。根據(jù)菌體生長情況來確定適宜的濃度。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖、酵母膏、磷酸二氫鉀為主要影響因素進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，以發(fā)酵液OD600為考察指標(biāo)，確定最佳組分。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

1.2.6 恒pH補(bǔ)料3L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn) 利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行3L發(fā)酵罐恒pH補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)，自動(dòng)流加25%的氨水維持pH恒定為7.0±0.3，用500g/L的葡萄糖濃縮液維持發(fā)酵液中葡萄糖含量為10g/L以上，每2h取樣離線檢測菌體生物量、殘?zhí)橇亢腿樗岷?，發(fā)酵時(shí)間為24h。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal tests

1.3 測定方法

1.3.1 生物量測定

1.3.1.1 菌體密度 取發(fā)酵培養(yǎng)液，以空白培養(yǎng)基為對照，用紫外可見分光光度計(jì)在600nm波長下測定。

1.3.1.2 菌體干重 取30mL發(fā)酵液于10000r/min離心10min后收集菌體，經(jīng)蒸餾水洗滌兩次后重新離心，去上清液后置于90℃烘箱干燥中過夜測定。

1.3.2 乳酸的測定 高效液相色譜法，發(fā)酵液離心后稀釋10倍，再經(jīng)0.45μm膜過濾，經(jīng)高效液相分析儀上樣測定。測定條件：色譜柱為Hypersil ODS（5μm，4.0mm×250mm），甲醇和0.01mol/L的磷酸5∶95為流動(dòng)相，流速為2.0mL/min，檢測波長為210nm，進(jìn)樣量為5μL[4]。

1.3.3 殘?zhí)堑臏y定 DNS法[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對菌體密度的影響

不同碳源對Lactococcus lactis SYFS1.009生長情況的影響見圖1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對菌體生長的影響大小排序是乳糖＞葡萄糖＞果糖＞麥芽糖＞蔗糖。葡萄糖和乳糖做碳源時(shí)，發(fā)酵液中菌體密度較高，綜合考慮原料成本與菌體生長情況，選擇葡萄糖作為碳源。

圖1 不同碳源對菌體濃度的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on the growth of bacteria

2.2 不同氮源對菌體密度的影響

不同氮源對Lactococcus lactisSYFS1.009生長情況的影響見圖2。由圖2可知，在酵母膏作為單一氮源的情況下，菌體濃度要高于其他氮源和混合氮源。這主要是由于酵母膏中尼克酸、葉酸、鈷胺酸含量較高，其在中、酸性環(huán)境中對熱穩(wěn)定，且富含多種氨基酸，對菌體生長有顯著的促進(jìn)作用[6]。因此選擇酵母膏作為最佳氮源。

圖2 不同氮源對菌體濃度的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on the growth of bacteria

2.3 緩沖鹽體系的篩選及確定

由表2可知，培養(yǎng)基中添加緩沖體系對菌體的增殖效果明顯高于對照組。不同的是，后兩組緩沖體系在低濃度時(shí)緩沖效果明顯優(yōu)于前四組，但隨著緩沖體系濃度的增大，前四組緩沖體系培養(yǎng)下的菌體密度不斷加大，在0.25mol/L的緩沖體系濃度下仍然有增加的趨勢，而后兩組菌體濃度則隨著緩沖鹽體系濃度增大呈先提高后降低的趨勢。

為進(jìn)一步優(yōu)化緩沖體系的研究結(jié)果，對磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀/氫氧化鈉、磷酸氫二鈉/檸檬酸、磷酸氫二鈉/磷酸二氫鉀四種緩沖體系進(jìn)行了更高濃度下菌體生長情況的研究。由圖3結(jié)果可見，在磷酸二氫鉀/氫氧化鈉緩沖體系下，菌體濃度隨緩沖體系濃度增加而增加，且在0.45mol/L時(shí)明顯高于其他組，OD值達(dá)到3.6。此時(shí)磷酸二氫鉀添加量約為42g/L。而其他三組緩沖體系在0.25mol/L的添加量后逐漸減低。因此選擇磷酸二氫鉀/氫氧化鈉作為最佳緩沖體系。

由上述實(shí)驗(yàn)知，磷酸二氫鉀/氫氧化鈉緩沖體系對乳酸乳球菌發(fā)酵液具有很高的緩沖能力，可能導(dǎo)致培養(yǎng)基中碳源、氮源完全消耗。為了更準(zhǔn)確地確定適宜的緩沖鹽濃度，對培養(yǎng)基中的碳、氮源濃度進(jìn)行了翻倍，分別為40g/L、50g/L。在此基礎(chǔ)上，分別在培養(yǎng)基中添加0～90g/L的磷酸二氫鉀（用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.0），以10g/L為增加量。以O(shè)D600為依據(jù)，選擇合適的磷酸二氫鉀濃度。由圖4可知，在碳、氮源加倍的情況下，發(fā)酵液OD600隨著磷酸二氫鉀濃度的增大呈先升高后降低的趨勢。OD600在40g/L磷酸二氫鉀濃度下達(dá)到最高，為4.14。隨后菌體密度逐漸減低，這可能是由于超高濃度的磷酸二氫鉀中高濃度的鉀離子，對細(xì)胞滲透壓造成了影響。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果知，40g/L的磷酸二氫鉀對乳酸乳球菌生長有顯著地促進(jìn)作用，然而這種高濃度的磷酸鹽作為發(fā)酵培養(yǎng)基的緩沖鹽是極為少見的，在乳酸菌發(fā)酵方面國內(nèi)未發(fā)現(xiàn)類似報(bào)道。而國外也僅有Vuyst等學(xué)者[7]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加50g/L的磷酸二氫鉀可以顯著增加nisin的產(chǎn)量。

圖3 不同濃度的四種緩沖鹽體系對菌體濃度的影響Fig.3 Effect of different four buffers on the growth of bacteria

圖4 不同濃度的磷酸二氫鉀對菌體濃度的影響Fig.4 Effect of K2HPO4content on the growth of bacteria

表2 不同緩沖鹽體系對Lactococcus lactis SYFS1.009菌體濃度的影響Table 2 Effect of different buffers on the growth of Lactococcus lactis SYFS1.009

2.4 碳氮源總量及碳氮比的篩選

碳源和氮源利用之間有密切的關(guān)系，二者之間的比例能夠直接影響微生物的生長和發(fā)酵產(chǎn)物的積累[8]。氮源過多則會使菌體生長過于旺盛，容易引起菌體的衰老和自溶；碳源過多則容易形成較低的pH，不利于菌體生長[9]。由圖5結(jié)果可知，菌體濃度隨培養(yǎng)基碳氮比例變化而變化，基本上是呈先增大后減小的趨勢。當(dāng)碳氮比為0.75時(shí)，菌體濃度較高。綜合考慮選擇碳氮總量為7%，碳氮比為0.75作為最佳碳氮組分。

圖5 碳氮總量和碳氮比對Lactococcus lactis SYFS1.009菌體濃度的影響Fig.5 Effect of different carbon nitrogen ratios on the growth of Lactococcus lactis SYFS1.009

2.5 微量元素、吐溫80對菌體濃度的影響

Mg、Mn、Cu、Fe等微量元素作為酶的激活劑或生物活性物質(zhì)的組成成分也是微生物在生長繁殖過程中所不可缺少的[10]，因此需要實(shí)驗(yàn)來確定它們的用量。圖6顯示了在分別添加了不同濃度的MgSO4，MnSO4·H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O和CuSO4的培養(yǎng)基中Lactococcus lactisSYFS1.009的生長情況。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，培養(yǎng)基中添加Mn2+、Mg2+對菌體生長有顯著的促進(jìn)作用?？紤]菌體生長情況，選擇MgSO4、MnSO4·H2O的添加量分別為100、600mg/L。FeSO4·7H2O和CuSO4在低濃度時(shí)對菌體生長有微弱的促進(jìn)作用，但濃度增大時(shí)，對菌體生長有很強(qiáng)的抑制作用，因此不考慮添加此兩種微量元素。

由圖7結(jié)果可知，吐溫80作為培養(yǎng)基中的表面活性劑，對菌體生長有微弱的促進(jìn)作用，因此選擇合適的吐溫80濃度為0.5mL/L。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

2.6.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)OD600對上述三個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

圖6 微量元素對菌體濃度的影響Fig.6 Effect of trace elements on the growth of bacteria

圖7 吐溫80對菌體濃度的影響Fig.7 Effect of Tween 80 content on the growth of bacteria

由表3和表4可以看出，在選定的水平范圍內(nèi)，三個(gè)因素對菌體密度影響大小次序?yàn)榱姿岫溻洠–）＞酵母膏（B）＞葡萄糖（A），葡萄糖對菌體生長具有顯著影響，酵母膏和磷酸二氫鉀對菌體生長情況具有極顯著影響。綜上可知，最佳工藝條件A1B2C2，即葡萄糖30g/L，酵母膏40g/L，磷酸二氫鉀40g/L。

2.6.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按A1B2C2最佳工藝條件進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，OD600為6.35，高于正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3中其他組合值。測定此條件下菌體干重為3.1g/L，是MRS相同培養(yǎng)條件下0.9g/L的3.4倍。

2.7 恒pH補(bǔ)料3L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)

在3L的發(fā)酵罐中接種發(fā)酵，自動(dòng)流加25%的氨水維持pH始終在7.0±0.3，并保持發(fā)酵液中葡萄糖含量在10g/L以上，發(fā)酵24h。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal tests

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 4 Variance analysis for OD value

圖8 3L發(fā)酵罐恒pH補(bǔ)料培養(yǎng)過程曲線Fig.8 Time curve of fermentation in 3L bioreactor

由圖8分析可知，接種后2h內(nèi)菌體生長基本屬于延滯期，乳酸產(chǎn)生量和葡萄糖消耗量均較小。2～10h為對數(shù)生長期，期間消耗大量的葡萄糖，并在葡萄糖含量低于10g/L的6h和8h添加葡萄糖，使發(fā)酵液中葡萄糖含量分別提高了8g/L和3g/L。在對數(shù)生長期內(nèi)，菌體濃度迅速提高，OD600從2.0提高到14.3，并在12h達(dá)到最高值15.3，此時(shí)菌體干重測得為7.3g/L。隨著葡萄糖的大量消耗，發(fā)酵液中乳酸含量也急劇增大，在10h就已高達(dá)36g/L，24h最終乳酸含量為45g/L。有文獻(xiàn)指出，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入緩沖體系和加堿中和可以較大程度上減緩乳酸對乳酸菌生長的抑制，但生成的乳酸鹽濃度過大時(shí)也會對菌體生長產(chǎn)生抑制[11]。由此分析可知，10h后菌體生長緩慢甚至衰減，并不是由于底物葡萄糖沒有及時(shí)補(bǔ)充，而是產(chǎn)生的乳酸和乳酸鹽有產(chǎn)物抑制效應(yīng)。為了更好提高菌體濃度，后期實(shí)驗(yàn)需在減少乳酸及乳酸鹽方面做更深入的研究。

3 結(jié)論

經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定Lactococcus lactisSYFS1.009最適培養(yǎng)基為：葡萄糖30g/L，酵母膏40g/L，磷酸二氫鉀40g/L，MgSO40.6g/L，MnSO4·H2O 0.1g/L，吐溫80 0.5mL/L。此條件下，14h發(fā)酵液OD600為6.32，干重為3.1g/L，是MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的3.4倍。在發(fā)酵罐恒pH補(bǔ)料12h后，發(fā)酵液OD600達(dá)到15.3，菌體干重為7.3g/L。

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Study on the high cell density culture of Lactococcus lactis

FENG Hui-jie，MU Wan-meng，ZHANG Tao，JIANG Bo*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to improve the cell density of Lactococcus lactis SYFS1.009，the fermentation culture medium and fed-batch culture conditions were studied.The optimum fermentation conditions by single-factor experiment and orthogonal experiment were determined：glucose 30g/L，yeast extract 40g/L，K2HPO440g/L，MgSO40.6g/L，MnSO4·H2O 0.1g/L，Tween 80 0.5mL/L.After cultivated in this medium for 14h at 30℃，DCW（dry cell weight）was 3.1g/L，which was about 3.4 times higher than in MRS（DCW 0.9g/L）.After 12h culture，the DCW was up to 7.3g/L and OD600was 15.3.

Lactococcus lactis；potassium dihydrogen phosphate；lactic acid

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0197-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.035

2013－11－20 *通訊聯(lián)系人

馮慧杰（1988-），男，碩士研究生，研究方向：食品加工新技術(shù)。

科技部十二五863計(jì)劃（2011AA100904）。