一株生防酵母菌的篩選鑒定及對葡萄采后病害的生防效果

李 強(qiáng)，張紅印，楊其亞，王峻峻，李超蘭（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

一株生防酵母菌的篩選鑒定及對葡萄采后病害的生防效果

李 強(qiáng)，張紅印*，楊其亞，王峻峻，李超蘭
（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

從桑葚中篩選得到一株具有潛在生防效力的酵母，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定及生物化學(xué)檢驗(yàn)，確定其為釀酒酵母。該酵母對葡萄采后黑曲霉病具有顯著的抑制效果，隨著酵母菌濃度的增高，葡萄腐爛率逐步降低；當(dāng)釀酒酵母濃度為1×108cfu/mL時(shí)，對葡萄黑曲霉病的抑制效果最好。在20℃和4℃條件下，該酵母在葡萄傷口處能快速繁殖，能顯著抑制葡萄自然腐爛率，而對其貯藏品質(zhì)影響不顯著。

篩選，鑒定，釀酒酵母，葡萄，采后病害，生物防治

葡萄營養(yǎng)豐富，具有很高食用價(jià)值及醫(yī)療保健價(jià)值，是我國五大名果之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全世界范圍內(nèi)，每年有27%左右的葡萄因采后處理不當(dāng)而損失[2]。目前針對葡萄保鮮，國內(nèi)外廣泛應(yīng)用二氧化硫防腐技術(shù)，其易導(dǎo)致葡萄漂白、傷害、異味等問題，極大降低葡萄貯藏品質(zhì)與商業(yè)價(jià)值[3-4]。近年來用微生物進(jìn)行水果采后病害的生物防治是國內(nèi)外發(fā)展起來的一個(gè)新的研究領(lǐng)域[5]。Wilson等報(bào)道指出可以利用水果表面的傷口分離拮抗酵母[6]。這種方法可以快速地篩選到拮抗酵母，從而縮小了篩選周期和費(fèi)用，已用于許多采后生物防治方案。

本論文從桑葚果中分離篩選得到一株拮抗酵母-Y-912。通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征以及分子生物學(xué)鑒定，確定該酵母為Saccharomyces cerevisiae（釀酒酵母）。目前，尚未見該酵母在水果采后生防中應(yīng)用的報(bào)道，因而具有很好的應(yīng)用潛景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄（Vitis vinifera） 品種為夏黑，購買于江蘇省句容市，早晨采摘后立即運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選擇無機(jī)械損傷、未感染、大小和成熟度等外觀品質(zhì)基本一致的果實(shí)，分組待用；桑葚（Fructus Mori） 采自江蘇省鎮(zhèn)江市江心洲生態(tài)果園。

全自動(dòng)高壓滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；雙層全溫?fù)u床 太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；血球計(jì)數(shù)板 丹陽市健陵醫(yī)療器械公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；ABI型基因擴(kuò)增儀 美國ABI公司；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀 北京六一；科龍BCD-276AK4型冰箱 廣東科龍電器股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：200g去皮馬鈴薯加水煮沸20min后過濾，濾液加入20g葡萄糖，20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌20min。

NYDA培養(yǎng)基：酵母浸膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，瓊脂20g加水至1000mL，121℃滅菌20min。

NYDA液體培養(yǎng)基：酵母浸膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，加水至1000mL，121℃滅菌20min。

McClary醋酸瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖1g，氯化鉀1.8g，酵母抽提物2.5g，三水醋酸鈉8.2g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 拮抗酵母的篩選 取桑葚，榨汁，取果汁1mL，放入裝有10mL無菌水的離心管中，充分振蕩混勻，取混勻液，做梯度稀釋（10-4、10-5、10-6、10-7），平板涂布法，涂布在NYDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)20～36h，挑取優(yōu)勢酵母單菌落，在固體NYDA平板劃線，純化培養(yǎng)，接種于NYDA斜面4℃下低溫保存。

1.3.2 形態(tài)學(xué)鑒定

1.3.2.1 液體培養(yǎng)特征 挑取已活化好的菌體1環(huán)接種到裝有NYDA液體培養(yǎng)基錐形瓶中，在25℃下靜置培養(yǎng)1～2d，過程中觀察并記錄。

1.3.2.2 固體培養(yǎng)特征 將活化好的菌株在NYDA斜面上劃線，25℃培養(yǎng)1～7d，過程中觀察并記錄。

1.3.2.3 有性階段觀察 在NYDA上25～28℃下培養(yǎng)2d，然后再轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種量應(yīng)盡量的少。觀察是否形成子囊，并記錄子囊的形成時(shí)間。

1.3.3 生理生化鑒定

1.3.3.1 糖類發(fā)酵 12.5%豆芽汁為基礎(chǔ)液，吸取一定量的糖液分裝于杜氏管，使糖濃度達(dá)到2%，然后將活化好的菌株分別接種于發(fā)酵管，25～28℃下培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果。

1.3.3.2 碳源同化 采用生長圖譜法來測定待測菌種對碳源的同化情況。

1.3.4 分子的生物學(xué)鑒定 擴(kuò)增拮抗酵母ITS序列的引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。以菌株DNA（菌體在溫度達(dá)到DNA變性溫度的時(shí)候裂解釋放出DNA）作為模板進(jìn)行以特異性引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先于平板培養(yǎng)基上挑一個(gè)單菌落于1mL無菌水中打勻制成菌懸液。于200滋L微量離心管中，依次加入超純水8.5滋L、正反引物各1滋L、PCRsupermix12.5滋L、待測酵母菌懸液2滋L。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃1min，54℃退火2min，72℃延伸2min，36個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送到上海生工生物工程服務(wù)有限公司測定。測序結(jié)果通過DNAStar、Chromas軟件校對，并在NCBI網(wǎng)站上利用Blast程序進(jìn)行核酸序列的比對分析。用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并分析。

1.3.5 拮抗酵母對葡萄采后黑曲霉病害的抑制效果 2%的次氯酸鈉溶液浸泡1min，清水洗凈，然后晾干。在果實(shí)腰部用打孔器打2個(gè)直徑為3mm、深為3mm的孔，每孔注射10滋L濃度為1×106、1×107、1×108以及1×109cfu/mL拮抗菌細(xì)胞懸液，2h后接種病原菌孢子懸液10滋L。晾干后將果實(shí)裝入塑料筐內(nèi)，保鮮膜封口保持95%的濕度，在20℃下貯藏，4d后統(tǒng)計(jì)果實(shí)的發(fā)病腐爛率。每處理30個(gè)果實(shí)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3.6 拮抗酵母在葡萄傷口處生長動(dòng)態(tài) 葡萄的表面打一個(gè)直徑為3mm、深為3mm的孔。用移液槍吸取10滋L 1×108cfu/mL的拮抗酵母菌懸液加入葡萄傷口處，將葡萄置于塑料筐中，用保鮮膜密封塑料筐，以保持塑料筐內(nèi)濕度（95%左右）。將塑料筐分別置于20℃和4℃的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間取樣測定果實(shí)傷口處的拮抗酵母數(shù)。采用張紅印測定方法[7]，每個(gè)處理重復(fù)3次，每次處理6個(gè)水果，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3.7 拮抗酵母對葡萄自然腐爛的抑制效果及貯藏品質(zhì)影響 配制1×108cfu/mL的拮抗酵母菌懸液，以無菌水作為對照。將完整無損的葡萄分別置于拮抗酵母懸浮液及無菌水中，浸泡30s時(shí)間，自然晾干后，用保鮮袋對葡萄進(jìn)行逐果包封，置于塑料筐中，進(jìn)行以下貯藏：a.在溫度為20℃相對濕度為95%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中貯藏15d；b.在溫度為4℃的冰柜中貯藏10d后轉(zhuǎn)入溫度為20℃相對濕度為95%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)貯藏7d。貯藏結(jié)束后統(tǒng)計(jì)果實(shí)發(fā)病率，并進(jìn)行貯藏品質(zhì)分析。每個(gè)處理重復(fù)3次，每次隨機(jī)挑選10個(gè)果實(shí)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。貯藏品質(zhì)分析方法如下：

1.3.7.1 失重率 采用稱重法。失重率（%）=（儲(chǔ)藏前質(zhì)量-儲(chǔ)藏后質(zhì)量）/儲(chǔ)藏前質(zhì)量×100。

1.3.7.2 硬度 采用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀測試，探頭直徑為5mm，探頭測試前、測試中、測試后的運(yùn)行速度都為1.0mm/s，測試深度為10mm，探頭插入水果時(shí)所受的最大阻力（單位為牛頓）就被定義為水果的硬度。每個(gè)水果繞赤道處每120°測定1次，測3次取平均值。1.3.7.3 總可溶性固形物 采用Larrigaudière等的方法[8]，采用WYT（0～80%）手持糖量計(jì)進(jìn)行測定，測定結(jié)果表示為g/100g樣品。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.7.4 可滴定酸度（%） 采用滴定法，參照郝建軍等的方法[9]。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.7.5 維生素C含量的測定 采用紫外快速測定法。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.7.6 褐變度 采用Lee的方法[10]。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SE）；并使用SPSS 19數(shù)據(jù)處理進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

2.1.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 Y-912菌株在NYDB液體培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)1d后，鏡檢，細(xì)胞呈卵圓形，無性繁殖方式芽殖；固體培養(yǎng)時(shí)，菌落呈乳白色，邊緣整齊，圓形，不透明，表面圓潤光滑。

2.1.2 子囊孢子的形成 Y-912菌株在生孢培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3d，形成子囊孢子，內(nèi)生4個(gè)孢子。

2.2 生理生化特征

待測酵母菌對相關(guān)糖類利用情況如下：

從表1可以看出，待測酵母Y-912對葡萄糖、蔗糖、海藻糖等能進(jìn)行發(fā)酵，對麥芽糖、乳糖、淀粉等不能進(jìn)行發(fā)酵；對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖等能進(jìn)行同化，對乳糖及淀粉等不能進(jìn)行同化。

2.3 分子學(xué)鑒定

將Y-912菌株ITS核酸序列與NCBI資料庫中已有的核酸序列作比對，其中Saccharomyces cerevisiaestrain AY939814.1曾發(fā)表于期刊Soil Science上的標(biāo)準(zhǔn)菌株，故Y-912菌株為Saccharomyces cerevisiae（釀酒酵母）。菌株Y-912與從GenBank獲得的菌株采用最大簡約法（max-imum parsimony method）構(gòu)建ITS進(jìn)化樹（圖1），明確表明該菌株是釀酒酵母菌。

表1 待測酵母菌對相關(guān)糖類利用情況Table 1 Take use of some carbohydrates

圖1 根據(jù)ITS區(qū)序列數(shù)據(jù)用最大簡約法參構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree using max-imum parsimony method based on ITS sequences

2.4 釀酒酵母葡萄黑曲霉病的控制效果

從圖2可以看出，與CK組相比，1×106、1×107、1×108、1×109cfu/mL的釀酒酵母Y-912均能顯著的抑制葡萄黑曲霉病（p＜0.05），且隨著濃度的增大抑菌效果增強(qiáng)。使用1×108cfu/mL的酵母，葡萄腐爛率降低了84.4%。

圖2 不同濃度Y-912對葡萄黑曲霉腐爛率的抑制效果Fig.2 Effect of the different concentrations of Y-912 in inhibiting Aspergillus niger decay of grapes

2.5 釀酒酵母在葡萄傷口處的生長動(dòng)態(tài)

從圖3（a）可以看出，20℃貯藏時(shí)，釀酒酵母Y-912在葡萄傷口處數(shù)目迅速增加，至第2d基本達(dá)到最大值；而4℃貯藏時(shí)（b）釀酒酵母在葡萄傷口處數(shù)目在初始得2d增加迅速到第3d達(dá)到最大值，但明顯低于20℃，之后數(shù)目開始減少。

2.6 釀酒酵母對葡萄自然腐爛及貯藏品質(zhì)的影響

圖3 釀酒酵母Y-912在葡萄傷口處的生長動(dòng)態(tài)Fig.3 Population dynamics of Saccharomyces cerevisiae Y-912 in the wound of grapes

2.6.1 Y-912對葡萄自然腐爛率的抑制效果 從圖4可看出，使用Y-912懸液處理果實(shí)，無論是貯藏在20℃還是4℃均能顯著抑制葡萄的自然腐爛率。在20℃貯藏15d后，經(jīng)酵母處理的葡萄自然腐爛率為38.3%，而對照組為51.7%；在4℃貯藏10d后轉(zhuǎn)入20℃貯藏7d后，經(jīng)酵母處理的葡萄自然腐爛率為41.7%，而對照組為61.7%。

圖4 Y-912對葡萄自然腐爛的控制效果Fig.4 Effect of Y-912 on natural decay development of grapes

2.6.2 Y-912對葡萄貯藏品質(zhì)的影響 從表2可以看出，在20℃貯藏15d，經(jīng)酵母處理的葡萄品質(zhì)與對照組無明顯差異。在4℃貯藏10d后再轉(zhuǎn)入20℃貯藏7d，經(jīng)酵母處理的葡萄除硬度和可溶性固形物與對照組差異顯著外，其他品質(zhì)并無明顯差異。說明使用Y-912處理葡萄對其貯藏品質(zhì)影響不顯著。

3 結(jié)論

本研究從桑葚中成功篩選到一株具有潛在生防作用的酵母—Y-912。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定以及分子學(xué)鑒定，確定該酵母為釀酒酵母。目前尚未有報(bào)道其被用于水果的采后病害抑制，因而具有良好的研究前景。

表2 Y-912對葡萄貯藏品質(zhì)的影響Table 2 Effect of Y-921 on postharvest natural quality parameters of grapes

黑曲霉是引起葡萄采后病害的重要致病菌，用釀酒酵母處理的葡萄，能有效地減少黑曲霉病的發(fā)生，且對黑曲霉菌的抑制作用與菌懸液濃度有關(guān)，當(dāng)酵母菌濃度為1×108cfu/mL，對黑曲霉菌的防治效果最好。從釀酒酵母在葡萄傷口處的生長動(dòng)態(tài)結(jié)果可以看出，該酵母能在水果傷口處迅速生長繁殖。這兩個(gè)結(jié)果說明了營養(yǎng)與空間的競爭在釀酒酵母抑制致病霉菌過程中所起的作用，釀酒酵母在水果的表面或傷口處迅速生長，占領(lǐng)表面或傷口處的營養(yǎng)空間，消耗了其中大量的營養(yǎng)物質(zhì)，從而起到抑制致病霉菌生長的作用。

釀酒酵母對葡萄整果貯藏時(shí)自然腐爛有顯著的抑制作用，顯示了釀酒酵母應(yīng)用于水果采后生物防治的潛力。經(jīng)釀酒酵母處理的葡萄，在貯藏期間的品質(zhì)指標(biāo)與對照相比，沒有造成不良影響。釀酒酵母能有效地抑制葡萄腐爛，使其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用于葡萄采后生防成為可能。釀酒酵母防治葡萄采后病害的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Screening and identification of an antagonistic yeast and its control efficacy to postharvest decay of grapes

LI Qiang，ZHANG Hong-yin*，YANG Qi-ya，WANG Jun-jun，LI Chao-lan
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

A strain of potential antagonistic yeast was isolated from mulberry fruits，which showed the biocontrol efficacy against postharvest decay of grapes.By molecular biological identification and biochemical examination，the antagonistic strain was identified as Saccharomyces cerevisiae.The antagonist showed significant biological control efficacy against postharvest decay of grapes caused by Aspergillus niger.When the concentration of the antagonist was higher，the disease incidence was lower.The concentration of S.cerevisiae was 1×108cfu/ mL，the inhibition effect of grapes diseased by Aspergillus niger was best.Rapid growth of the antagonists in wounds was observed at 20℃ and 4℃.S.cerevisiae significantly reduced the natural development of decay and did not have significant effect on postharvest natural quality.

screening；identification；Saccharomyces cerevisiae；grapes；postharvest decay；biocontrol

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0182-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.032

2013－10－24 *通訊聯(lián)系人

李強(qiáng)（1987-），男，碩士研究生，研究方向：食品微生物學(xué)。

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20123227110015）；鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科技支撐項(xiàng)目（NY2013004）。