青刺尖茶抑菌作用的初步研究

劉 剛，方 玉，楊 妍，張曉喻，*，黎 霞，楊 雪（.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都600；2.四川師范大學(xué)植物資源應(yīng)用與開發(fā)研究所，四川成都600）

青刺尖茶抑菌作用的初步研究

劉 剛1，2，方 玉1，楊 妍1，張曉喻1，2，*，黎 霞1，楊 雪1
（1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610101；2.四川師范大學(xué)植物資源應(yīng)用與開發(fā)研究所，四川成都610101）

目的：研究青刺尖茶的水提物和醇提物的抑菌作用。方法：采用濾紙片擴(kuò)散法和試管二倍稀釋法對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)定抑菌圈直徑、最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），比較研究水提物和醇提物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，并初步研究pH、溫度對(duì)青刺尖茶提取物抑菌作用的影響。結(jié)果：青刺尖茶水提液對(duì)兩種菌都有不同程度的抑制作用，對(duì)大腸桿菌的抑制作用明顯大于對(duì)金黃色葡萄球菌，醇提液對(duì)大腸桿菌有顯著抑制作用。青刺尖茶水提液的抑菌最適pH5～6，對(duì)熱穩(wěn)定。結(jié)論：青刺尖茶水提液對(duì)大腸桿菌具有很強(qiáng)的抑菌效力，水提液的抑菌作用明顯優(yōu)于醇提液。

青刺尖茶，提取物，抑菌作用

青刺尖（Prinsepia utilis Royle）屬薔薇科扁核木屬的落葉灌木，別名炮筒果、牛奶捶、梅花刺等[1]，雌雄同株，冬季開花，夏季結(jié)果，分布于云貴川、西藏等地[2-3]。其根、莖、葉和果實(shí)均可入藥，在川滇的納西族、白族、彝族、摩梭人等民族中有上千年的應(yīng)用歷史?！顿F州草藥》和《中藥大詞典》記載：青刺尖莖葉主治癰疽毒瘡，風(fēng)火牙痛，槍傷，骨折，蛇咬傷；根主治虛咳，久咳，積食，風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；果主治目翳多淚，消化不良等[4-5]。

近年對(duì)青刺尖進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)它具有很高的藥用價(jià)值[6]、營養(yǎng)價(jià)值[7]、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值[8]，其莖葉有抗炎功能[9]、抗脂質(zhì)過氧化、抗紫外線損傷和改善微循環(huán)等作用，其果油有很高的營養(yǎng)價(jià)值[10]，有耐缺氧[11]、抗腦缺氧[12]、調(diào)節(jié)血脂等[13]功能。對(duì)青刺尖莖、葉和果實(shí)的抑菌作用的研究均有文獻(xiàn)報(bào)道，張榮先等[14]對(duì)青刺尖果實(shí)、根、莖與葉4部位水提液的抑菌效果進(jìn)行研究，結(jié)果表明果實(shí)和根均有不同程度的抑菌作用，果實(shí)提取液的明顯比根好。朱正良等[15]對(duì)青刺果提取液的抑菌進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果表明青刺果提取液有更強(qiáng)的抑菌效力，抑菌濃度較低，熱穩(wěn)定性更好。賈琳等[16]比較青刺果油與普洱茶的抗菌效果，發(fā)現(xiàn)青刺果油、普洱茶水混合物對(duì)食品腐敗菌有明顯的抑菌作用。李福杏等[17]進(jìn)行青刺果種籽粕的石油醚提取物對(duì)3種細(xì)菌的體外抑菌活性研究，結(jié)果表明提取物對(duì)3種常見致病細(xì)菌均有不同程度的抑菌或者殺菌作用。蒲中慧等[18]用柱層析法對(duì)青刺果種籽粕粉乙酸乙酯提取物進(jìn)行體外抑菌作用研究，結(jié)果表明提取物及柱層析組分均有不同程度的抑菌或殺菌作用。

綜上，青刺尖是一種很有開發(fā)前景的民族藥用植物，其根、莖、葉和果實(shí)均具有明顯的抑菌效果，但目前，以綠茶制作工藝制備的青刺尖茶的功能研究尚未見報(bào)道，對(duì)青刺尖茶水抑菌作用的研究也未見報(bào)道。本文首次以青刺尖茶為材料，采用濾紙片擴(kuò)散法和試管二倍稀釋法，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，比較抑菌效力，為進(jìn)一步開發(fā)功能性青刺尖茶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青刺尖茶 產(chǎn)自鹽源縣左所鄉(xiāng)，成都某公司；大腸桿菌和金黃色葡萄球菌 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；普通瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；肉湯培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；乙醇、氨芐青霉素 成都市長(zhǎng)征化玻有限公司；其他所用試劑 均為分析純。

R-1005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；LDZX-50KB型立體壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；ESJ205-4型電子分析天平 沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱、DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SWCJ-2F型超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHG-9240型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH.W21型恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；回流冷凝裝置，打孔器，定性濾紙等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青刺尖茶提取物的制備

1.2.1.1 青刺尖茶水提物的制備 稱取青刺尖茶50g加入1000mL沸水，60℃回流提取2次，每次1h，過濾，合并濾液，濃縮至50mL（含藥量相當(dāng)于1g/mL），冷藏備用。

1.2.1.2 青刺尖茶醇提物的制備 稱取青刺尖茶50g加入1000mL 70%乙醇，60℃回流提取2次，每次1h，過濾，合并濾液，濃縮至50mL（含藥量相當(dāng)于1g/mL，即1mL含1g原料），冷藏備用。

1.2.2 青刺尖茶提取物體外抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 藥敏紙片的制備 用打孔器制備直徑為6mm的圓形濾紙片，121℃滅菌20min，烘干放入不同的提取液中浸泡12h，取出后放至無菌平皿中，烘干，低溫備用。

1.2.2.2 菌懸液的制備 斜面活化金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，37℃恒溫培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落分別接種于新鮮液體肉湯培養(yǎng)基中，無菌水稀釋菌懸液至所需濃度，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定兩種菌的活菌數(shù)（CFU）。

1.2.2.3 抑菌活性的測(cè)定 采用濾紙片擴(kuò)散法，參考陳麗鳳等的方法[19]，取直徑90mm無菌平皿，制備好普通瓊脂培養(yǎng)平板。用滅菌的棉簽分別蘸取上述兩種細(xì)菌均勻涂布于瓊脂平板表面，待平板水分干燥后，用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼在平板上，每個(gè)平板貼4張，以無菌水作空白對(duì)照組，氨芐青霉素作陽性對(duì)照組，每種提取物設(shè)置3個(gè)平行，擴(kuò)散15min，37℃恒溫培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈直徑。根據(jù)有無抑菌圈及抑菌圈直徑大小判定提取物抑菌效果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2.4 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 采用試管二倍稀釋法，取12支無菌試管，每管加2.00mL滅菌普通肉湯培養(yǎng)基，于第1支試管中加入提取物2.00mL，混勻后吸取2.00mL至第2管，混勻后吸取2.00mL至第3管，如此連續(xù)稀釋至第10管，混勻后棄去2.00mL；第11管為不加提取物作為空白對(duì)照，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，第12管加入提取物2.00mL，混勻棄去2.00mL，不加細(xì)菌，觀察受試提取物是否有污染。編號(hào)1～11的試管中加入菌液0.1mL（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均稀釋成105cfu/mL），混勻后37℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。與第11管、第12管對(duì)比，不發(fā)生混濁變化的最高藥物稀釋倍數(shù)為該藥物的MIC值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將所有清晰無菌生長(zhǎng)的試管培養(yǎng)液接種于營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)24h，以菌落數(shù)不超過5個(gè)的最低藥物濃度為該藥物的MBC值。

1.2.2.5 pH和溫度對(duì)青刺尖茶抑菌作用的影響 將青刺尖茶提取液的pH分別調(diào)為4、5、7和8，以未處理過的提取液（pH為6）為空白對(duì)照，采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈直徑。每處理3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將青刺尖茶提取液在30、60、80、121℃水浴條件，熱處理20min，以未處理過的提取液為空白對(duì)照，采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈直徑。每處理3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性的測(cè)定

在普通營養(yǎng)瓊脂上，采用濾紙片擴(kuò)散法，研究青刺尖茶水提物和醇提物分別對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用，結(jié)果見表1。

從表1可知，青刺尖茶提取物對(duì)兩種供試菌都有不同程度的抑制作用，其中青刺尖茶水提液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為：（18.00± 0.817）、（10.75±0.500）mm，分別達(dá)到高敏和中敏的抑菌效果，表明青刺尖茶水提液對(duì)大腸桿菌的抑制作用明顯高于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用；青刺尖茶醇提液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為（8.75±0.500）mm，抑菌效果表現(xiàn)為低敏，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果（6.75±1.708）mm，顯著低于對(duì)大腸桿菌的作用，結(jié)果表明，青刺尖茶水提物對(duì)大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑制活性。

空白組的抑菌圈直徑為0.00，表明培養(yǎng)未受外來污染的影響，無菌操作嚴(yán)格可控，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可信。實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析表明，與空白組（無菌水組）比較，青刺尖茶兩種提取物的p＜0.01，差異極顯著，青刺尖茶水提液和醇提液的抑菌效果明顯，均有顯著抑菌效果；與陽性對(duì)照氨芐青霉素組比較，提取物的抑菌圈均較小，p＜0.01，差異極顯著。表明：青刺尖茶提取物具有的抑菌效果顯著比陽性組的氨芐青霉素弱很多，但明顯比空白組強(qiáng)。與大腸桿菌組比較，金黃色葡萄球菌組的p＜0.01，說明：青刺尖茶兩種提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果具有極顯著的差異。青刺尖茶水提液的抑菌效果明顯高于醇提液。

表1 青刺尖茶提取物對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌圈直徑Table 1 The bacteriostatic circle diameter of Prinsepia utilis tea extract on two kinds of bacteria

2.2 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

采用試管二倍稀釋法，研究青刺尖茶提取物的MIC和MBC，實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表2和表3。

青刺尖茶提取物對(duì)兩種細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）有顯著差異，其中，水提物對(duì)金黃色葡萄球菌為15.63mg/mL，而對(duì)大腸桿菌為3.91mg/mL；醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌為125mg/mL，而對(duì)大腸桿菌為31.25mg/mL。

表2 青刺尖茶提取物對(duì)兩種細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）Table 2 The minimal inhibitory concentration of Prinsepia utilis tea extract on two kinds of bacteria

青刺尖茶水提物對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC最小，均為3.91mg/mL，表明其對(duì)大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，與陽性組比較，差異極顯著（p＜0.01），抑菌效果均小于陽性組，與濾紙片擴(kuò)散法得出的結(jié)果一致。青刺尖茶醇提液對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC均為31.25mg/mL，與水提液組比較，青刺尖茶醇提液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為125mg/mL，MBC為250mg/mL，差異極顯著（p＜0.01），表明青刺尖茶醇提液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果較水提物弱很多。青刺尖茶抑菌的主要功效性成分很可能存在于其水提物部分，其在70%醇溶劑中具有部分溶解性。

2.3 pH和溫度對(duì)抑菌作用的影響

初步考察了pH和溫度對(duì)青刺尖茶提取物抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的影響，見圖1和圖2。對(duì)于其他因素對(duì)青刺尖茶兩種提取液抑菌作用的影響，有待進(jìn)一步深入的研究。

圖1 pH對(duì)青刺尖茶抑菌作用的影響Fig.1 The influence of pH on Prinsepia utilis tea

表3 青刺尖茶提取物對(duì)兩種細(xì)菌的最低殺菌濃度（MBC）Table 3 The minimal concentration of Prinsepia utilis tea extract on two kinds of bacteria

從圖1可知，青刺尖茶兩種提取液對(duì)細(xì)菌的抑制作用，在pH為5～6時(shí)達(dá)到最大，與前后的pH比較，差異顯著（p＜0.05），在過酸或過堿的條件，都會(huì)影響抑菌效果，因此，青刺尖茶的最適抑菌pH為5～6。從圖2可知，溫度對(duì)青刺尖茶兩種提取液的抑菌效果的影響不大，均不顯著（p＞0.05），從30～120℃抑菌曲線趨于水平，此表明，青刺尖茶兩種提取液的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。

圖2 溫度對(duì)青刺尖茶抑菌作用的影響Fig.2 The influence of temperature on Prinsepia utilis tea

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究為利用青刺尖茶開發(fā)功能性飲品或口服液提供了理論基礎(chǔ)，豐富了新型天然功效性保健飲品的種類，研究為后續(xù)探討該茶的抑菌成分做了一定理論鋪墊，同時(shí)為開發(fā)天然植物抑菌劑及抑菌產(chǎn)品提供了新的植物資源。大腸桿菌（革蘭陰性菌）和金黃色葡萄球菌（革蘭陽性菌）是2類常見的食品源性的病原微生物，以抑菌圈直徑、MIC和MBC為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用濾紙片擴(kuò)散法和試管二倍稀釋法，研究青刺尖茶兩種提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果，并對(duì)pH和溫度對(duì)抑菌的影響做了考察，可得出以下結(jié)論：

3.1 青刺尖茶兩種提取物均有一定的抑菌功效。與空白對(duì)照組比較，青刺尖茶兩種提取物的抑菌效果顯著的強(qiáng)；而與氨芐青霉素比較，兩種提取物的抑菌圈均顯著較小。

3.2 青刺尖茶兩種提取物對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌效果顯著不同。統(tǒng)計(jì)分析表明，對(duì)兩種菌的抑菌效果，其水提液與醇提液比較有顯著性差異，水提液的抑菌效果明顯高于醇提液。此結(jié)果說明，青刺尖茶的主要抑菌功效成分很可能存在于水提液中，為水溶性抑菌活性成分，在70%乙醇溶液中只有部分溶解性。青刺尖茶水提液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果達(dá)到高敏，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果為中敏，而其醇提液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果為低敏，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用不顯著。青刺尖茶兩種提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果，均明顯高于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，青刺尖茶提取物水溶部分對(duì)革蘭氏陰性菌具有較強(qiáng)的抑制作用，而醇溶部分對(duì)革蘭氏陽性菌抑制作用不顯著。

3.3 青刺尖茶水提液抑菌作用在低濃度能達(dá)到效果，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC（MBC）分別為：3.91、15.63mg/mL，此值較小，表明青刺尖茶水提液具有較強(qiáng)的抑菌功能。

3.4 青刺尖茶提取物抑菌的最適pH范圍為5～6，其對(duì)熱穩(wěn)定。選取主要影響細(xì)菌生長(zhǎng)的pH和溫度因素，對(duì)抑菌效果進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，過酸過堿均影響其抑菌的效果，青刺尖茶提取物在pH5～6時(shí)有很強(qiáng)的抑菌作用，在30～120℃穩(wěn)定性較好，此為最佳抑菌參數(shù)（MIC、活性pH范圍、最適抑菌溫度等）的探索提供了理論的支持，同時(shí)為后續(xù)開發(fā)功能青刺尖茶飲或口服液，做了一定的理論鋪墊。

綜上所述，青刺尖茶的兩種提取物均具有不同程度的抑菌效果，抑菌作用明顯，由強(qiáng)到弱依次為：水提液抑制大腸桿菌＞水提液抑制金黃色葡萄球菌＞醇提液抑制大腸桿菌＞醇提液抑制金黃色葡萄球菌。青刺尖茶水提液抑制大腸桿菌的MIC為：3.91mg/mL。青刺尖茶抑菌的最適pH范圍為5～6，對(duì)熱穩(wěn)定。

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Basic study on antimicrobial actions of Prinsepia utilis tea

LIU Gang1，2，F(xiàn)ANG Yu1，YANG Yan1，ZHANG Xiao-yu1，2，*，LI Xia1，YANG Xue1
（1.College of Life Sciences，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China；2.Institute of Phytochemistry，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China）

Objective：To investigate the antimicrobial actions about the water extract and the alcohol extract of Prinsepia utilis tea.Methods：The tube 2-fold dilution method and Kirby-Baueer Disc Diffusionto were used to test the inhibitory of the two extract for S.aureus and E.coli.To compare the two extract’s antimicrobial effect against the E.coli and S.aureus，the antibacterial circle diameter，minimum inhibitory concentration（MIC）and minimal bactericidal concentration（MBC）were measured.The influence of pH and temperature on Prinsepia utilis tea bacteriostatic action were further studied.Results：The water extract of P.utilis tea had antimicrobial effect on both S.aureus and E.coli，specifically，its antimicrobial effect was more apparently on the E.coli than the S.aureus，while the ethanol extract of P.utilis tea only had bacteriostatic effect on E.coli.The optimum bacteriostatic pH for water extract was 5 to 6.Conclusion：The water extract of Prinsepia utilis tea had the strongest antimicrobial actions on E.coli.Compared with the alcohol extract，the water extract had relatively stronger antibacterial effect.

Prinsepia utilis tea；extract；antimicrobial acions

TS218

A

1002-0306（2014）14-0114-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.016

2013-10-28 *通訊聯(lián)系人

劉剛（1968-），男，副教授，主要從事植物成分分離、功能方面的研究。

四川師范大學(xué)“土壤污染原位修復(fù)與綠色食品藥品開發(fā)”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（14yb29）；攀枝花市科技局項(xiàng)目（2014CY-C-1）。