籽瓜多糖硫酸酯的制備工藝、化學(xué)結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性研究

劉 琴，宋 珅，殷振雄，王興凱，張 繼，2，*（.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730070）

籽瓜多糖硫酸酯的制備工藝、化學(xué)結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性研究

劉 琴1，宋 珅1，殷振雄1，王興凱1，張 繼1，2，*
（1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730070）

從籽瓜中提取籽瓜多糖（SWP），用氯磺酸-吡啶法制備籽瓜多糖硫酸酯（SSWP）。以籽瓜多糖硫酸酯中硫含量為指標(biāo)，依據(jù)響應(yīng)面設(shè)計對影響硫酸酯中硫含量的反應(yīng)時間、溫度和酯化試劑的比例（氯磺酸∶吡啶）三個因素進行優(yōu)化組合。得出最佳組合條件為：反應(yīng)時間3.2h，溫度61℃，酯化試劑的比例（氯磺酸∶吡啶）1∶1.3。在此條件下，籽瓜多糖硫酸酯中硫含量可達到11.98%。用紅外光譜對籽瓜多糖進行了掃描，在1250.76、810.74cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰，說明硫酸化是成功的。用GC-MS分析其單糖組成，結(jié)果表明籽瓜多糖硫酸酯由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖六種單糖組成，摩爾比為4.29∶11.72∶8.66∶5.35∶13.62∶56.36。用體積排阻色譜測得籽瓜多糖硫酸酯的分子量，重均分子量Mn=2.717×105，數(shù)均分子量Mw=1.232×105。通過測定籽瓜多糖和籽瓜多糖硫酸酯對DPPH自由基、羥自由基的清除率，表明籽瓜多糖硫酸酯對羥基自由基及DPPH自由基的清除率比未酯化前顯著提高。

籽瓜多糖，硫酸化，化學(xué)結(jié)構(gòu)，抗氧化活性

籽瓜，是一種潤肺、暖胃的保健食品，富含果酸、核黃酸、尼可酸等18種氨基酸、維生素及多種微量元素，具有利尿、潤肺、健脾的功效，對糖尿病、肥胖癥也有輔助醫(yī)療作用，籽瓜入藥可作“白虎湯”藥引[1-3]。多糖是一類由單糖組成的天然高分子化合物，廣泛存在于動、植物和微生物中。其中植物多糖如人參、枸杞、蘆薈、牛膝、刺五加等均具有增強免疫力、抗腫瘤、降血糖、抗衰老、抗病毒作用等功能[4-5]。多糖硫酸化修飾是指多糖大分子鏈中糖基單元上的羥基被硫酸基團所取代形成半合成酸性多糖的修飾過程。不具有生物活性或者生物活性很低的天然多糖經(jīng)過硫酸化修飾后可獲得生物活性或者提高生物活性[6]。研究發(fā)現(xiàn)海藻中的硫酸多糖具有體內(nèi)抗氧化及抗腫瘤作用[7]；海洋無脊椎動物中提取出來的硫酸多糖具有較強的抗艾滋病病毒活性[8]；豆渣多糖硫酸化修飾后，硫酸酯化豆渣多糖對羥基自由基、DPPH自由基的清除作用比未酯化前的豆渣多糖有明顯的提高[9]；金頂側(cè)耳子實體中分離純化得到的多糖，經(jīng)硫酸酯化后，抗柯薩奇病毒B5的活性明顯增強[10]；王翠平對籽瓜皮和瓢作了研究，表明籽瓜皮和籽瓜瓤具有一定的清除DPPH·、OH-·、ABTS+·自由基能力和抑制肝癌細(xì)胞7721生長的活性，可以作為一種良好的天然抗氧化劑及抗腫瘤活性物質(zhì)[11]。目前有關(guān)籽瓜多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾以及抗氧化活性等生理活性作用研究還未見報道，本實驗用氯磺酸-吡啶法制備籽瓜多糖硫酸酯，確定了籽瓜多糖硫酸酯的最優(yōu)制備工藝條件，并對籽瓜多糖硫酸酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)做了研究及其硫酸化前后的抗氧化活性做了比較，以期為籽瓜的高值化開發(fā)利用和籽瓜多糖研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

籽瓜 采自甘肅省白銀市靖遠縣，新鮮籽瓜去皮去除瓜子后，切碎，勻漿機6000r/min粉碎成汁，待用；氯磺酸（ClSO2OH）、吡啶（C5H5N）、甲酰胺（CH3NO）、三氟乙酸（C2HF3O2）、鹽酸羥胺（HONH3Cl）、氯仿、乙酸酐、溴化鉀、K2SO4、NaOH、H2O2、無水乙醇、HCl、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水楊酸、三氯乙酸、K2HPO4、KH2PO4、FeSO4均為分析純。

BL320H型電子天平 日本島津；JRA-6型數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；TDL5M型臺式大容量冷凍離心機 湘儀離心機廠；LGJ-185型真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；SB-35型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA；UV1000型紫外可見分光光度計 Labtech；IS10型傅立葉紅外光譜儀、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo；EA3000型元素分析儀 德國；FSH-2A型可調(diào)高速分散器 常州華冠儀器制造有限公司；多角度激光光散射儀 λ=690nm，DAWN EOS，Wyatt Technology Co.，USA。

1.2 實驗方法

1.2.1 籽瓜多糖的制備 取一定量預(yù)處理后的籽瓜汁，以蒸餾水為溶劑，根據(jù)文獻[12]中所述的方法提取籽瓜多糖。提取液經(jīng)過4000r/min離心10min，60℃減壓濃縮至20mL，加入無水乙醇80mL，醇沉24h 5000r/min離心10min，取下層沉淀，-60℃冷凍干燥得到籽瓜粗多糖。籽瓜粗多糖經(jīng)木瓜蛋白酶和Sevage偶聯(lián)法脫去蛋白，60℃減壓濃縮至10mL，加入無水乙醇40mL，醇沉24h，5000r/min離心10min，取下層沉淀，-60℃冷凍干燥得到籽瓜多糖。

1.2.2 酯化試劑的制備 在一個100mL的三口圓底燒瓶上，分別連接上恒壓滴液漏斗、冷凝管和攪拌器。將整套裝置置于冰鹽浴中，在不斷攪拌下，先將無水吡啶加入到三口燒瓶中，然后將ClSO3H加入恒壓漏斗，打開恒壓漏斗的活塞，控制滴速為10滴/min，使ClSO3H緩慢的逐滴滴加到反應(yīng)器中，經(jīng)過一定時間（1h左右）的反應(yīng)，即得到酯化試劑[13]。

1.2.3 酯化反應(yīng) 準(zhǔn)確稱取0.2g籽瓜多糖并將其溶解于15mL甲酰胺中，加入20mL配制好的硫酸酯化試劑，在一定溫度下攪拌反應(yīng)一定時間，反應(yīng)結(jié)束后用3moL/L NaOH中和至pH為7，流水透析48h，蒸餾水透析48h，除去副產(chǎn)物，60℃減壓濃縮，-60℃冷凍干燥得硫酸化籽瓜多糖。測定產(chǎn)物硫酸酯化籽瓜多糖中的硫含量。

1.2.4 硫含量（S%）測定 硫含量采用元素分析法測定[13]。

分析條件：氧化爐溫度980℃，熱導(dǎo)檢測器與色譜柱溫度115℃，載氣壓力80kPa，載氣流速125mL/min，加氧量20mL，氧氣壓力50kPa，分析時間320s。

1.2.5 籽瓜多糖硫酸酯化最佳工藝條件的確定 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇對籽瓜多糖硫酸酯中硫含量影響顯著的因素進行響應(yīng)面優(yōu)化，實驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 實驗因素、水平及編碼表Table 1 Experiment factors,levels and code

1.2.6 籽瓜多糖硫酸酯的FT-IR分析 充分干燥的樣品與KBr壓片，用Thermo Nicolet iS10紅外光譜儀在400～4000cm-1范圍內(nèi)掃描，掃描次數(shù)16次，分辨率4cm-1。

1.2.7 籽瓜多糖硫酸酯的分子量測定 采用體積排阻色譜-光散射聯(lián)用進行測定[14]。

樣品用超純水配制成一定濃度后，用0.22μm微孔濾膜過濾，進樣量為50μL，流速為0.5mL/min，柱溫30℃，以超純水做流動相，光散射公式為：

K是一個光學(xué)常數(shù)，其值等于是[4π2n2（dn/dc）2]/（λ4NA）；C是多糖濃度mg/mL，Rθ為瑞利因子；n是溶劑的折光系數(shù)，dn/dc為折光指數(shù)的增加量；NA是阿伏伽德羅數(shù)；A2是第二維利系數(shù)，λ=690nm，色譜柱以多糖分子量不同進行分離，每一個組分都對應(yīng)各自的散射強度，示差折光檢測器可以給出多糖的濃度。

1.2.8 籽瓜多糖硫酸酯的GC-MS分析 糖腈乙酸酯衍生物的制備：10mg SSWP，加4mL 4mol/L的CF3COOH，充N2，120℃密閉水解8h。80℃減壓蒸干水解液，加入10mg鹽酸羥胺，0.5mL吡啶，90℃油浴中反應(yīng)30min。加入0.5mL乙酸酐，90℃乙?；?0min，反應(yīng)產(chǎn)物75℃減壓蒸干。

衍生物的GC-MS分析：用1mL的三氯甲烷充分溶解衍生物，0.22μm有機濾膜過濾。吸取0.2μL進樣，GC-MS分析。

分析條件：以160℃開始，保留3min，以2℃·min-1線性升到210℃。載氣為氦氣，柱流量1.0mL·min-1，進樣口溫度：250℃；質(zhì)譜條件：EI源；電離電壓：70eV；離子源溫度：250℃；掃描范圍：33～550aum；分流比：50∶1[15]。

對照標(biāo)準(zhǔn)單糖：葡萄糖（Glu）、甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）、核糖（Rib）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rha）、來蘇糖（Lyx）做同樣處理。

多糖樣品有六種單糖組成：葡萄糖（Glu）、甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rha）。

1.2.9 SSWP和SWP的抗氧化活性研究[16]。

1.2.9.1 SSWP和SWP對DPPH自由基的清除作用 精確稱取一定量的SSWP，用適量蒸餾水充分溶解，制成濃度為5.0mg/mL的母液，依次稀釋成濃度分別為2、1、0.6、0.2、0.1、0.06、0.02mg/mL。

精確稱取一定量的SWP，配制為濃度為5.0mg/mL的母液，依次稀釋至濃度分別為2、1、0.6、0.2、0.1、0.06、0.02mg/mL。

分別量取不同濃度的SSWP溶液、SWP溶液各2mL，分別與0.5mL濃度為2.0×10-4mol/L的DPPH溶液混合，搖勻后置于暗處放置30min，以相對應(yīng)的溶劑為對照，在517nm處測定吸光值A(chǔ)i。

分別量取不同濃度的SSWP溶液、SWP溶液各2mL，分別與2mL相對應(yīng)的溶劑混合均勻后，以溶劑為對照，在517nm處測定吸光值A(chǔ)j。

量取0.5mL濃度為2.0×10-4mol/L的DPPH溶液與0.5mL蒸餾水混合，以相對應(yīng)的溶劑為對照，在517nm處測定吸光值A(chǔ)c。計算清除率公式如下：

1.2.9.2 SSWP和SWP對羥基（·OH）自由基的清除作用 精確稱取一定量的SSWP，用適量蒸餾水充分溶解，制成濃度為5.0mg/mL的母液，依次稀釋至濃度分別為2、1、0.6、0.2、0.1、0.06、0.02mg/mL。精確稱取一定量SWP，配制為濃度為5.0mg/mL的母液，依次稀釋至濃度分別為2、1、0.6、0.2、0.1、0.06、0.02mg/mL。

分別量取不同濃度的SSWP、SWP溶液各2mL，依次加入6mmol/L的FeSO4溶液2mL，混勻后加入6mmol/L的H2O2溶液2mL，混勻，靜置10min，再加入6mmol/L的水楊酸溶液2mL，混勻，靜置30min后于510nm處測定吸光值A(chǔ)i；用蒸餾水代替水楊酸測定Aj?？瞻讓φ找噪p蒸水代替SSWP和SWP，測定A0。根據(jù)以下公式計算清除率：

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA）后采用SPSS 13.0處理，響應(yīng)面采用Design-Expert 8.0用Originpro 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽瓜多糖硫酸化修飾的單因素實驗

圖1 酯化試劑比例對硫含量的影響Fig.1 The effect of esterifying reagent ratio on the sulfur content

由圖1得知，在反應(yīng)時間為3h，溫度為60℃條件下，當(dāng)氯磺酸和吡啶的體積比小于1∶1時，氯磺酸含量少，酯化不完全，硫酸化籽瓜多糖中硫含量低；當(dāng)體積比大于1∶1時，由于氯磺酸是一種強酸物質(zhì)，反應(yīng)體系中氯磺酸的含量太高，酸性太強，會導(dǎo)致多糖部分降解，且容易產(chǎn)生板結(jié)現(xiàn)象，很難攪拌，反應(yīng)不均勻，影響硫酸化的效果[17]。因此，氯磺酸與吡啶的體積比太大或太小都會影響硫酸酯化的效果，因此選最佳比例為1∶1。

圖2 反應(yīng)時間對硫含量的影響Fig.2 The effect of reaction time on the sulfur content

由圖2可知，在反應(yīng)溫度為60℃，氯磺酸和吡啶的體積比例為1∶1條件下，隨著時間的增加，硫酸化籽瓜多糖的硫含量呈先增加后降低的趨勢。一定范圍內(nèi)，酯化時間增加，有助于酯化反應(yīng)的進行；但是在高酸性的條件下，酯化時間過長，也會引起多糖的部分降解，導(dǎo)致酯化度有所下降，硫含量降低[18]。因此選擇反應(yīng)時間為3h。

由圖3得知，在反應(yīng)時間為3h，氯磺酸和吡啶的體積比例為1∶1條件下，隨著反應(yīng)溫度的增加，硫酸化籽瓜多糖的硫含量呈先增加又降低的趨勢。當(dāng)溫度大于60℃時，硫含量降低，可能是由于籽瓜多糖在高溫的酸性環(huán)境下發(fā)生了降解。因此選擇最佳反應(yīng)溫度為60℃。

圖3 反應(yīng)溫度對硫含量的影響Fig.3 The effect of reaction temperature of the sulfur content

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化籽瓜多糖硫酸酯的制備工藝

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計的實驗原理，在單因素的實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，對影響籽瓜多糖硫酸酯中硫含量的時間、溫度和酯化試劑的體積比（氯磺酸∶吡啶）三個因素，通過三因素三水平的Box-Benhnhen設(shè)計，依據(jù)回歸分析確定最佳提取工藝條件，實驗結(jié)果如表2所示。

表2 實驗方案及結(jié)果Table 2 Experimental solutions and results

2.2.2 回歸模型的建立與分析 通過SAS數(shù)據(jù)分析軟件對表2中數(shù)據(jù)進行處理，得到回歸模型的方差分析結(jié)果（表3）以及多元二次回歸模型方程：

Y（%）=11.95+0.26X1+0.57X2+0.18X3+0.51X1X2-0.20X1X3+0.25X2X3-3.19X12-1.35X22-0.94X32。

用ANOVA分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)。由表3可知．酯化試劑比例X1、作用時間X2、酯化試劑比例和作用時間的交互項X1X2以及酯化試劑比例的二次項X12、作用時間的二次項X22、溫度X32的二次項都達到極顯著水平（p＜0.01）；溫度X3以及溫度和作用時間的交互項X2X3達到顯著水平（p＜0.05）。

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significance test and variance analysis for the regression model

由方差分析（表3）可以看出，模型Prob＞F值小于0.01，表明該模型方程極顯著，不同處理間的差異高度顯著，說明這種實驗方法是準(zhǔn)確可靠的。采用F檢驗方法對模型的顯著性進行分析，結(jié)果表明模型是極顯著的，可以采用回歸模型對響應(yīng)值進行預(yù)測?？梢杂迷撃Ｐ头匠虂矸治龊皖A(yù)測不同條件下硫酸化多糖中硫含量的變化。

2.2.3 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)硫酸化多糖硫含量回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面圖見圖4～圖6。

圖4 酯化試劑比例和時間的響應(yīng)面圖Fig.4 The response surface map of esterifying reagent ratio and the time

由圖4酯化試劑比例和時間對硫酸化籽瓜多糖硫含量的交互影響的響應(yīng)面圖可以看出，隨著時間的延長，硫酸化籽瓜多糖硫含量逐漸增高，時間達到3h后，多糖硫含量趨于平衡，酯化時間增加，有助于酯化反應(yīng)的進行；但是在高酸性條件下，酯化時間過長，會引起多糖部分降解；氯磺酸和吡啶的體積比小，氯磺酸含量少，酯化不完全，硫酸化籽瓜多糖中硫含量低；氯磺酸的含量太高，酸性太強，會導(dǎo)致多糖部分降解，且容易產(chǎn)生板結(jié)現(xiàn)象，難攪拌，反應(yīng)不均勻，影響硫酸化的效果。

圖5 溫度和酯化試劑比例的響應(yīng)面圖Fig.5 The response surface map of temperature and time

圖5 是反應(yīng)溫度與酯化試劑比例對硫酸化籽瓜多糖硫含量的交互影響響應(yīng)面圖，可以看出，溫度升高，多糖的硫酸酯的水解反應(yīng)也進一步增加，同時由于溫度升高，多糖的降解也加劇，因此，溫度過高以及酸性太強都不利于酯化反應(yīng)的進行。

圖6 溫度和時間的響應(yīng)面圖Fig.6 The response surface map of temperature and time

由圖6可以看出，酯化時間增加，有助于酯化反應(yīng)的進行；但是在高酸性的條件下，酯化時間過長，也會引起多糖的部分降解；溫度太低不利于反應(yīng)的進行，太高又會造成多糖水解。

2.2.4 優(yōu)化提取參數(shù)和驗證模型 結(jié)合二次回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果得出籽瓜多糖硫酸化的最佳工藝參數(shù)為：酯化試劑的比例（氯磺酸∶吡啶）1∶1.29，反應(yīng)時間3.23h，溫度61.22℃，在此條件下，籽瓜多糖酸酯中硫含量可達到12.0332%。為了檢驗響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳工藝條件進行籽瓜多糖硫酸化工藝的驗證實驗，同時考慮到實際操作和生產(chǎn)的便利，因此將籽瓜多糖硫酸化的最佳工藝參數(shù)修訂為：酯化試劑的比例（氯磺酸∶吡啶）1∶1.3，反應(yīng)時間3.2h，溫度61℃，在此條件下，重復(fù)五次，籽瓜多糖酸酯中硫含量可達到11.98%±0.236%。因此，優(yōu)化得到的籽瓜多糖的硫酸化工藝條件具有實際應(yīng)用價值。

2.3 籽瓜多糖硫酸酯的紅外光譜掃描

SWP及CSA/Py法合成的SSWP的紅外圖譜見圖7。從SWP的FT-IR圖譜可以看到，3426.38cm-1處為O-H伸縮振動，2916.75cm-1為亞甲基的C-H伸縮振動，1053.14cm-1處為一級O-H的變角振動。從SSWP的FT-IR圖譜可知，其多糖母體特征吸收并未發(fā)生變化，在1250.76、810.74cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰。其中，1250.76cm-1為S=O的不對稱伸縮振動，810.74cm-1為C-O-S的伸縮振動。此外，2917cm-1處C-H的吸收峰減弱，說明SWP的-OH發(fā)生不同程度的取代。

圖7 籽瓜多糖和籽瓜多糖硫酸酯的紅外光譜Fig.7 The IR spectra of watermelon polysaccharide and sulfated watermelon polysaccharides

根據(jù)文獻報道，800～850cm-1之間的區(qū)域可用來推測硫酸基在糖環(huán)上的取代位置。850、830、810cm-1左右分別對應(yīng)于3位、2位和6位取代[19]。根據(jù)以上規(guī)律，推測SSWP主要是在C-6位-OH上發(fā)生了取代，部分也在發(fā)生C-2取代。

2.4 籽瓜多糖硫酸酯的分子量測定

圖8 SWP和SSWP的SEC-LLS色譜圖Fig.8 SEC-LLS chromatograms of SWP and SSWP Laser light scattering photometry

表4 SWP和SSWP的分子量分布Table 4 Molecular weight of SWP and SSWP

表4為SWP和SSWP的分子量大小，由表4可知籽瓜多糖（SWP）經(jīng)硫酸化修飾后分子量變小，分子量分布變窄。由圖8也得出SSWP在色譜柱中的保留時間比SWP要長一些，這是因為根據(jù)SEC體積排阻的原理，分子量小的組分在色譜柱中的保留時間越長，越晚出峰。造成SSWP分子量減小的原因可能是SWP分子在酸性環(huán)境中發(fā)生了降解[14]。

2.5 籽瓜多糖硫酸酯的GC-MS分析

圖9為SWP、SSWP和標(biāo)準(zhǔn)單糖水解衍生物GC-MS圖，其單糖組成及摩爾比見表5。

圖9 標(biāo)準(zhǔn)單糖的GC圖和籽瓜多糖、籽瓜多糖硫酸酯的GC圖Fig.9 The GC photo of the standard monosaccharide and the GC photo of SWP and SSWP

表5 SWP和SSWP的單糖組成及摩爾比Table 5 Monsaccharide composition and molar ratio of SWP and SSWP

圖9為標(biāo)準(zhǔn)單糖、SWP和SSWP的水解衍生物的GC-MS圖，其單糖組成及摩爾比見表5。由圖9可知，SSWP和SWP一樣都由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖六種單糖組成，說明硫酸酯化反應(yīng)只影響到了取代基。但是SSWP的單糖摩爾比與SWP相比發(fā)生了較大的變化，鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖的量有所降低，木糖和葡萄糖的量有所增加。這是由于SSWP在TFA中水解時-SO3-會從糖鏈中斷裂，SSWP完全水解成了原來的單糖[14]。

2.6 籽瓜多糖與籽瓜多糖硫酸酯的體外抗氧化活性測定

圖10 SWP和SSWP對DPPH自由基和羥自由基的清除能力比較Fig.10 The comparison of scavenging capacity of SWP and SSWP on DPPH radical and hydroxyl radical

如圖10所示，在所選濃度范圍內(nèi)，SWP和SSWP對DPPH自由基和羥自由基的清除率隨濃度的增加而增大。與SWP相比，硫酸化改性后的SSWP顯示出更強的清除DPPH自由基和羥自由基的能力，是因為籽瓜多糖鏈中引入了硫酸基，使糖分子極性增大，溶解度增加，黏度降低，從而增強了與羥自由基和DPPH自由基的結(jié)合能力[15]。

3 結(jié)論

3.1 采用氯磺酸-吡啶法制備籽瓜多糖硫酸酯（SSWP），通過單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化得到籽瓜多糖硫酸酯的最佳合成條件為：酯化試劑的比例（氯磺酸∶吡啶）1∶1.3，反應(yīng)時間3.2h，溫度61℃，在此條件下，籽瓜多糖酸酯中硫含量可達到11.98%，工藝可行，可以用于籽瓜多糖酸酯的制備。

3.2 研究了籽瓜多糖硫酸酯（SSWP）的化學(xué)結(jié)構(gòu)，與籽瓜多糖（SWP）相比，經(jīng)過硫酸化修飾得到的SSWP的分子量有所降低，單糖組分沒有發(fā)生變化，但是單糖摩爾比發(fā)生了改變，鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖的量有所降低，木糖和葡萄糖的量有所增加。

3.3 籽瓜多糖（SWP）和籽瓜多糖硫酸酯（SSWP）對DPPH自由基和羥自由基都有一定的清除作用，相比較而言，籽瓜多糖經(jīng)硫酸化修飾后的籽瓜多糖硫酸酯（SSWP）的清除作用更強。

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Study on preparation，chemical structure and antioxidant activity of polysaccharide sulfate from watermelon

LIU Qin1，SONG Shen1，YIN Zhen-xiong1，WANG Xing-kai1，ZHANG Ji1，2，*
（1.College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China；2.Research Center for Gansu Distinctive Plants，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China）

Watermelon polysaccharide（SWP）was extracted from watermelon and watermelon polysaccharide sulfate（SSWP）was prepared by chlorosulfonic acid-pyridine.The sulfur content in sulfated watermelon polysaccharide as an indicator，based on response surface design（Response surface methodology，RSM），the combination of three factors：the effect of sulfur in sulfate reaction time，temperature and esterification reagent ratio（chlorosulfonic acid：pyridine）was optimized.The reaction time of 3.2h，reaction temperature of 61℃，and the ratio of esterification of reagent（chlorosulfonic acid∶pyridyl）which was 1∶1.3 were the optimum combination of conditions.Under this condition，the content of sulfur in sulfated watermelon polysaccharides was up to 11.98%.Watermelon polysaccharide were scanned by IR spectra showing new absorption peak appeared at 1250.76cm-1and 810.74cm-1，which indicated that the sulfation was successful.Its monosaccharide composition was analysed by GC-MS，which showed that watermelon polysaccharide was composed of six kinds of monosaccharide：rhamnose，arabinose，xylose，mannose，glucose，galactose，and the molar ratio was 4.29∶11.72∶8.66∶5.35∶13.62∶56.36.Its molecular weight was measured by size exclusion chromatography（SEC），Mn= 2.717×105，Mw=1.232×105.By measuring the scavenging rates of sulfated watermelon polysaccharide on DPPH radicals，hydroxyl radical and reducing power，it showed that the sulfated watermelon polysaccharides had significantly improved on scavenging rates and reducing power of hydroxyl radical and DPPH radical than the unesterified ones before.

watermelon polysaccharides；sulfated；chemical structure；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0107-07

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.015

2013－10－14 *通訊聯(lián)系人

劉琴（1988-），女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)方面的研究。

國家自然基金（31200255）；西南突發(fā)性災(zāi)害應(yīng)急與防控技術(shù)集成與示范（2012BAD36B04）。