交替假單胞菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的響應(yīng)面優(yōu)化

王曉輝，岳 敏（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連116023；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

交替假單胞菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的響應(yīng)面優(yōu)化

王曉輝1，2，3，岳 敏2，3
（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連116023；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

采用響應(yīng)面法對交替假單胞菌發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。首先利用Plackett Burman實驗設(shè)計篩選出影響產(chǎn)酶的3個主要因素，即膠體幾丁質(zhì)、發(fā)酵溫度和pH。在此基礎(chǔ)上用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域，再利用Box-Behnken實驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法確定最佳條件。結(jié)果表明，膠體幾丁質(zhì)8.95g/L，蛋白胨2g/L，轉(zhuǎn)速130r/min，接種量2%，發(fā)酵溫度20℃，pH6.18，發(fā)酵時間96h，幾丁質(zhì)酶最大理論酶活為57.95U/mL。經(jīng)3次實驗驗證，實際平均酶活與預(yù)測酶活相近，比優(yōu)化前幾丁質(zhì)酶酶活提高了23.77%。

交替假單胞菌，幾丁質(zhì)酶，發(fā)酵，響應(yīng)面分析

幾丁質(zhì)（chitin），俗稱甲殼素、甲殼質(zhì)，由N-乙酰葡萄糖胺單體以β-1，4-糖苷鍵連接起來的直鏈多聚物，是自然界中含量最豐富，海洋環(huán)境中僅次于纖維素的第二大可再生資源。幾丁質(zhì)廣泛存在于甲殼綱動物蝦蟹、昆蟲的甲殼，以及真菌（酵母，霉菌）、藻類、植物的細(xì)胞壁中[1]。據(jù)估測，海洋環(huán)境每年超過1011噸幾丁質(zhì)形成，其降解主要是通過產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物完成[2-3]。

幾丁質(zhì)酶（Chitinase，EC3.2.1.14）是專一降解幾丁質(zhì)為幾丁寡糖或幾丁單糖的一組酶的總稱[3]。根據(jù)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的同源性，將其分為18和19兩個家族。其中，18家族幾丁質(zhì)酶廣泛存在于病毒、微生物、植物和動物中，而19家族幾丁質(zhì)酶主要存在于植物中。另外，在鏈霉菌屬和一些擬諾卡氏菌屬的放線菌中也發(fā)現(xiàn)了19家族幾丁質(zhì)酶[4-5]，18家族和19家族幾丁質(zhì)酶之間沒有序列相似性，說明它們由不同祖先進(jìn)化而來[6]。

微生物幾丁質(zhì)降解系統(tǒng)主要由內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（chitinase，EC 3.2.1.14）、外切幾丁質(zhì)酶（chitinase，EC 3.2.1.14）和β-N-乙酰己糖胺酶（β-N-acetylhexosaminidase，EC 3.2.1.52）組成。內(nèi)切幾丁質(zhì)酶在高聚幾丁質(zhì)鏈內(nèi)隨機(jī)切割生成幾丁質(zhì)寡糖（chitooligosaccharides，（GlcNAc）n，n＞2）；外切幾丁質(zhì)酶有兩種，分別從高聚幾丁質(zhì)鏈的還原端和非還原端依次切割下（GlcNAc）2；β-N-乙酰己糖胺酶將從非還原端將幾丁質(zhì)寡糖切割成為GlcNAc。某些物種中還發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，起到分散幾丁質(zhì)糖鏈?zhǔn)淖饔肹7-8]。幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)產(chǎn)生的幾丁寡糖、幾丁單糖及其衍生物由于具有良好的組織兼容性和生物降解性以及調(diào)節(jié)免疫力和抗癌的保健功能等特點，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[9-10]。

交替假單胞菌（Pseudoalteromonas）是海洋環(huán)境產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的典型微生物，據(jù)報道該屬可產(chǎn)生7種不同類型幾丁質(zhì)酶，該幾丁質(zhì)降解系統(tǒng)包括4種幾丁質(zhì)酶，3種N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，1種糖基轉(zhuǎn)移酶，1種幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白和1種幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白酶，協(xié)同降解幾丁質(zhì)，應(yīng)用潛力巨大[11-13]。但國外已報道的交替假單胞菌野生菌生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量都比較低，國內(nèi)未見該菌屬生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的相關(guān)報道。本文從海洋底泥樣品中篩選到高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的交替假單胞菌，命名為PseudoalteromonasDL-6（CGMCC NO.8580），擬通過響應(yīng)面優(yōu)化策略，進(jìn)一步提高其幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量，為后期幾丁質(zhì)酶的分離純化、底物特異性與寡糖生產(chǎn)等酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

交替假單胞菌（Pseudoalteromonas sp.DL-6） 篩選自中國遼寧大連渤海海域近海底泥6～100m（123° 371′E，39°6972′N）；活化培養(yǎng)基（1000mL） 膠體幾丁質(zhì)10.0g，胰蛋白胨5.0g，瓊脂粉15.0g，原地海水配制，pH自然；2216E斜面保藏培養(yǎng)基（1000mL）[14]牛肉膏1.0g，蛋白胨5g，瓊脂粉15g，原地海水配制，pH自然；種子培養(yǎng)基（1000mL） 牛肉膏1.0g，蛋白胨5g，原地海水配制，pH自然；發(fā)酵培養(yǎng)基（1000mL） 膠體幾丁質(zhì)5g，蛋白胨5g，原地海水配制，pH自然；幾丁質(zhì)粉 美國Sigma公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

LRH系列生活培養(yǎng)箱、HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠；Thermo Multiskan Ascent型酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠體幾丁質(zhì)的制備[14]稱取10.0g幾丁質(zhì)粉加100mL濃鹽酸，攪拌均勻，加去離子水1.0L，反復(fù)洗至中性，最后用PBS（pH7.0）緩沖液重溶，配制成1%膠體幾丁質(zhì)溶液，避光保存于冰箱備用。

1.2.2 粗酶液制備 于2216E斜面保藏培養(yǎng)基挑取1環(huán)種子到液體種子培養(yǎng)基，20℃，130r/min搖床培養(yǎng)24h后，接種1%至發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)4d，5000r/min下離心10min，收集上清液為粗酶液測酶活。

1.2.3 酶活檢測 取粗酶液0.1mL與0.9mL，1%膠體幾丁質(zhì)混合，20℃下保溫30min后，將反應(yīng)混合物加熱在沸水浴中10min終止酶反應(yīng)，10，000×g離心5min，取上清0.5mL，加入1mL Schales試劑[15]，沸水浴10min，測定OD420nm，設(shè)3個重復(fù)，取平均值，跟據(jù)N-乙酰-D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活力。酶活單位定義（U）：在上述條件下，1min催化產(chǎn)生相當(dāng)于lμmol的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量。

1.2.4 實驗設(shè)計

1.2.4.1 Plackett-Burman設(shè)計法篩選幾丁質(zhì)酶酶活的顯著因素 根據(jù)前期優(yōu)化單因素實驗結(jié)果，分析可能影響Pseudoalteromonassp.DL-6發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的眾多因素包括：氮源、碳源、轉(zhuǎn)速、接種量、發(fā)酵溫度、pH、培養(yǎng)時間。用PB設(shè)計對以上7個因素進(jìn)行全面考察，以軟件Minitab設(shè)計N=12的7因素，2水平的Placket-Burman實驗。并設(shè)計4項虛擬項（A、E、F、H）。各因素對應(yīng)因子代碼如表1所示。

表1 Plackett-Burman實驗設(shè)計各因素水平及分析Table 1 Levels of the variables and statistical analysis of Plackett-Burman design

1.2.4.2 最陡爬坡實驗 根據(jù)Plackett-Burman的實驗結(jié)果，做最陡爬坡實驗，最陡爬坡法以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域。確定Box-Behnken的中心點。

1.2.4.3 Box-Behnken實驗設(shè)計 根據(jù)Plackett-Burman實驗得到的三個顯著因素及最陡爬坡實驗的確定的中心點，設(shè)計N=15的3因素3水平實驗。以膠體幾丁質(zhì)X1、溫度X2、pH X3為自變量設(shè)計N=15組的Box-Behnken實驗。如表2所示。

表2 響應(yīng)面因素設(shè)計水平表Table 2 Range of different factor invested in RSM

1.3 數(shù)據(jù)分析

Plackett-Burman設(shè)計法是一種多因素、兩水平的實驗設(shè)計方法，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素，供進(jìn)一步研究用[16]。最陡爬坡實驗用以確定Box-Behnken實驗的中心點，使B-B實驗因素所取水平能最大程度的逼近最佳值區(qū)域。Box-Behnken設(shè)計用以確定因素對響應(yīng)值的二次方程，從而計算出在選定范圍內(nèi)各因素的最佳值[17-19]。本文采用Minitab軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所做實驗結(jié)果均有3組重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的P-B（Plackett-Burman）設(shè)計

由表1和Minitab軟件得到PB實驗設(shè)計，每組配方做三個平行樣，N=12的PB實驗設(shè)計及3次酶活的平均值結(jié)果如表3所示。

表3 Plackett-Burman設(shè)計結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design matrix for evaluating factors influencing

表4 P-B實驗設(shè)計各因素主效應(yīng)分析結(jié)果Table 4 Results of the variables and effect in P-B design

通過軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得多元一次回歸方程：

R1=52.04+0.33B+0.46C+1.39D-0.17G+0.079J+ 0.60K+0.83L

式中，R1為酶活的預(yù)測值；B、C、D、G、J、K、L分別為時間、蛋白胨、膠體幾丁質(zhì)、接種量、轉(zhuǎn)速、溫度、pH的編碼水平。

根據(jù)實驗結(jié)果，該模型顯著（p=0.0160＜0.05）。從表4可以看出，膠體幾丁質(zhì)（D），pH（L），發(fā)酵溫度（K）的p值（Prob＞F）小于0.05，說明這三個因素是主要響應(yīng)因素，后續(xù)采用響應(yīng)面分析法對這三個因素進(jìn)行進(jìn)一步研究。

其他因素對響應(yīng)值影響均不顯著，正效應(yīng)的因素選取較高值（發(fā)酵時間96h、蛋白胨2g/L、轉(zhuǎn)速為130r/min），負(fù)效應(yīng)的因素選取較低值（接種量2%）進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 最陡爬坡實驗

根據(jù)Plackett-Burman實驗得出：膠體幾丁質(zhì)，發(fā)酵溫度和pH為影響發(fā)酵顯著的三個因素，根據(jù)P-B實驗結(jié)果設(shè)計最陡爬坡實驗如表5所示。膠體幾丁質(zhì)、溫度和pH均為顯著正效應(yīng)。得到最佳因子組為第2組：膠體幾丁質(zhì)8g/L，pH7.0，發(fā)酵溫度15℃，以最佳因子組作B-B實驗的中心點。

表5 最陡爬坡實驗設(shè)計及實驗結(jié)果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 響應(yīng)面實驗優(yōu)化培養(yǎng)條件

2.3.1 B-B（Box-Behnken）實驗設(shè)計 由Plackett-Burman實驗和最陡爬坡實驗確定的3個顯著性因素和3個水平。以膠體幾丁質(zhì)X1、溫度X2、pH X3為自變量設(shè)計N=15組的Box-Behnken實驗。每組實驗進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果取3次實驗的平均值，結(jié)果如表6所示。

表6 Box-Behnken設(shè)計結(jié)果Table 6 Box-Behnken design with three independent variables

2.3.2 多元二次回歸方程的建立及顯著性檢驗 根據(jù)Minitab軟件對實驗結(jié)果分析得二次回歸方程：

Y=56.05+1.921X1+0.516X2+0.398X3-2.211X12-0.821X22-1.669X32+1.333X1X2-1.200X1X3-1.930X2X3。

對方程進(jìn)行回歸系數(shù)顯著性檢測和方差分析，見表7。

根據(jù)響應(yīng)面方差分析結(jié)果，模型失擬項p=0.2009，影響不顯著，模型顯著（p=0.0007），說明模型選擇比較合適?；貧w系數(shù)R2=98.25%大于90%，說明模型相關(guān)度很好。因此認(rèn)為可用來代替真實實驗點對實驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。由表7回歸系數(shù)的顯著性檢驗可知，因素X1、X2對產(chǎn)酶的線性效應(yīng)均顯著，X3對產(chǎn)酶的線性效應(yīng)不顯著。

表7 回歸方差系數(shù)表Table 7 Coefficient of regression equation

2.3.3 響應(yīng)面分析及最優(yōu)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的確定 在獲得回歸非線性模型之后，為了求得各因子最佳值，根據(jù)所得到的回歸模擬方程分別對各變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，并令其為零，得到一個三元一次方程組，求解此方程組可得到模型的極值，即當(dāng)膠體幾丁質(zhì)8.95g/L、發(fā)酵溫度20℃、pH6.18時，96h理論最大幾丁質(zhì)酶酶活為57.925U/mL。

圖1 溫度與膠體幾丁質(zhì)交互影響酶活的響應(yīng)曲面圖Fig.1 Response surface plot of the effects of temperature and chitin colloidal chitin on the enzyme activity

圖2 pH與膠體幾丁質(zhì)交互影響酶活的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface plot of the effects of pH and colloidal chitin on the enzyme activity

根據(jù)二次多項式模型利用Minitab軟件繪出響應(yīng)面分析圖，見圖1～圖3。每個響應(yīng)面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時第三個變量的編碼值為零。由響應(yīng)面圖可以看出：膠體幾丁質(zhì)、發(fā)酵溫度、pH三個因素之間存在著明顯的交互作用，在實驗水平范圍內(nèi)，隨著膠體幾丁質(zhì)、發(fā)酵溫度、pH的量增加，幾丁質(zhì)酶酶活呈先增加后降低的趨勢。當(dāng)膠體幾丁質(zhì)、發(fā)酵溫度、pH分別為8.95g/L，20℃，6.18時達(dá)到最佳，幾丁質(zhì)酶酶活的理論值為57.925U/mL。

圖3 pH和溫度交互影響酶活的響應(yīng)曲面圖Fig.3 Response surface plot of the effects of pH and temperature on the enzyme activity

為了驗證模型的準(zhǔn)確性，同時考慮到實際操作的可能性，將最佳發(fā)酵條件的參數(shù)進(jìn)行取整，即膠體幾丁質(zhì)9.0g/L、蛋白胨2g/L、轉(zhuǎn)速為130r/min、接種量2%、發(fā)酵溫度20℃、pH6.0、發(fā)酵時間96h，進(jìn)行3次搖瓶發(fā)酵實驗，所得幾丁質(zhì)酶的平均酶活為57.95U/mL。優(yōu)化前各參數(shù)分別為：膠體幾丁質(zhì)10.0g/L、蛋白胨5g/L、轉(zhuǎn)速為160r/min、接種量2%、發(fā)酵溫度15℃、pH自然、發(fā)酵時間48h，酶活為46.82U/mL，相比優(yōu)化前采用響應(yīng)面優(yōu)化后酶活為57.95U/mL，提高了23.77%?？梢娫撃Ｐ湍軌蜉^好地預(yù)測實際發(fā)酵情況。

3 結(jié)論

在交替假單胞菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶搖瓶發(fā)酵過程中，膠體幾丁質(zhì)、發(fā)酵溫度和pH是重要因素。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化的培養(yǎng)條件為膠體幾丁質(zhì)8.95g/L，發(fā)酵溫度20℃，pH6.18。根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果最大酶活并結(jié)合實驗的實際情況，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：膠體幾丁質(zhì)9.0g/L、蛋白胨2g/L、轉(zhuǎn)速為130r/min、接種量2%、發(fā)酵溫度20℃、pH6.0、發(fā)酵時間96h。在該優(yōu)化發(fā)酵條件下，酶活力達(dá)57.95U/mL，較初始發(fā)酵條件（酶活46.82U/mL）提高了23.77%。

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Optimization of fermentation conditions for chitinase production by the Pseudoalteromonas sp.DL-6 using the response surface methodology

WANG Xiao-hui1，2，3，YUE Min2，3
（1.School of Life Science and Biotechnology，Dalian University，Dalian 116622，China；2.Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023，China；3.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Response surface methodology was used to optimize the fermentation conditions of chitinase by Pseudoalteromonas sp.DL-6.Firstly，the important factors influencing chitinase production were identified by the method of Plackett-Burman as colloidal chitin，fermentation temperature，and pH.The path of steepest ascent was applied to approach the optimal region of the three significant factors.Box-Behnken design and response surface analysis were used to further investigate the optimal central levels and relationships of these factors.By using the quadratic regression model equation and analyzing the response surface of chitinase production，the optimal fermentation conditions were determined as followed：colloidal chitin 8.95g/L，peptone 2g/L，shaking speed 130r/min，inoculums dose 2%，fermentation temperature 20℃，and pH 6.18，respectively. Under these conditons，the maximumtheoretic activity of chitinase was 57.95U/mL.After three verifications，the maximum theoretic value was consistent with mean value of verification test and the chitinase production was increased by 23.77%comparing to that before optimization.

Pseudoalteromonas；chitinase；fermentation；response surface analysis

TS201.3

B

1002-0306（2014）12-0312-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.060

2014－02－20

王曉輝（1981-），女，在職博士，講師，研究方向：微生物與酶工程。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2007AA021306）。