蝦有效致敏組分的提取及在sIgE檢測中的初步應(yīng)用*

任 杰 單立新 李韶深 陳 凱 侯麗英 李會強△

食物過敏已成為當(dāng)今社會常見衛(wèi)生問題之一，流行病學(xué)研究資料顯示，成年人食物過敏性疾病患病率為1%～2%[1]。食物過敏性疾病主要通過病史、體內(nèi)皮膚點刺試驗和體外血清特異性IgE（specific IgE，sIgE）檢測等方法來診斷。檢測血清sIgE是確定過敏原的重要方法之一，已被臨床廣泛采用[2]。檢測血清sIgE是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理[3]，即用食物提取蛋白溶液作為已知抗原包被在固相材料表面，以實現(xiàn)對未知抗體的檢測。食物蛋白組分復(fù)雜，只有獲取有效過敏原成分，才能提升血清sIgE檢測結(jié)果的靈敏度。中華對蝦是一種常見過敏性食物，研究表明原肌球蛋白雖然是蝦肉中一種重要過敏原[4]，但并不是唯一、特有的過敏原[5]。因此，若使用蝦蛋白總提取物作為包被抗原，必定會影響檢測敏感度；若使用單一組分作為包被抗原，很有可能因為過敏原的地域性差異而導(dǎo)致檢驗結(jié)果的假陰性。本課題組前期研究結(jié)果表明：與血清sIgE相結(jié)合的蝦蛋白組分主要集中在分子質(zhì)量大于70 ku的蛋白，并且有些條帶反應(yīng)較強[6]。本研究通過分離出蝦中的大蛋白組分，并以此作為血清sIgE檢測的包被（已知）抗原，觀察能否有效提高蝦類sIgE檢測結(jié)果的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 垂直板型電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)印槽（美國BIO-RAD公司）；紫外分光光度計（美國Thermo sci?entific公司）；EXL-800型酶標(biāo)分析儀（Biotek公司）。

1.1.2 主要試劑 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉（SDS）、四甲基乙二胺(TEMED)、吐溫-20（Tween-20）均購自美國Sigma公司；蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)SM0671(MBI Fermentas公司)；聚偏二氟乙烯（PVDF）購自美國Millipore公司；馬抗人IgE-HRP抗體(美國Southern Biotech公司)；兔抗人IgE-AP抗體(美國Jackson Immunoresearch公司)；96孔酶標(biāo)反應(yīng)板(美國Costar公司)。

1.1.3 陽性患者血清和陰性對照血清 血清標(biāo)本均來自天津市北辰醫(yī)院。蝦過敏患者血清共14例，均采用德國Medi?wiss公司生產(chǎn)的Allergy Screen過敏原檢測系統(tǒng)檢測sIgE的含量。且患者皮膚點刺試驗均出現(xiàn)了不同程度的陽性反應(yīng)。陰性對照血清5例：來自健康體檢者，無過敏家族史、無食物過敏史、血清總IgE水平在正常范圍（20～200 IU/mL）。血清均保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫印跡法分析與血清sIgE結(jié)合的蝦蛋白組分 （1）提取蝦蛋白溶液（命名為Native），經(jīng)SDS-PAGE技術(shù)分析蛋白組分。樣品蛋白濃度為14 g/L，蛋白樣品與上樣緩沖液1∶2混合，煮沸5 min，上樣20 μg；分離膠12%，堆積膠5%。以65 V電壓堆積樣本，135 V電壓分離樣品1 h。（2）蛋白轉(zhuǎn)印。采用濕轉(zhuǎn)方式，250 mA恒流，濕轉(zhuǎn)60 min，將蛋白條帶濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，后經(jīng)5%脫脂牛奶4℃封閉過夜，風(fēng)干后備用。（3）免疫印跡。將14例陽性和1例陰性血清1∶10稀釋后，分別和PVDF膜孵育3 h；TBST洗膜5次后加入1∶250稀釋的兔抗人IgE-AP抗體，室溫孵育1 h；TBST洗膜5次；加入AP顯色底物避光顯色15 min；將膜取出用蒸餾水洗凈，吹干后觀察顯色條帶。

1.2.2 葡聚糖凝膠層析法分離蝦有效致敏蛋白 采用Se?phrose 6B葡聚糖填充材料填充XK-50層析柱，用0.01 mol/L pH 7.4 PBS緩沖液平衡柱子，先將蝦蛋白溶液經(jīng)0.22 μm孔徑大小的濾膜濾除雜質(zhì)后上樣。以1 mL/min的流速洗脫蛋白，每管收集量為1 mL，核酸/蛋白檢測儀器檢測280 nm處光吸收，后經(jīng)SDS-PAGE觀察層析效果。

1.2.3 兩種已知抗原溶液用于sIgE檢測的比較 分別采用酶斑點印跡法和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（間接ELISA法）對兩種已知抗原進(jìn)行評價，蝦蛋白溶液經(jīng)Sephrose 6B葡聚糖分離獲得的第一個收集峰命名為peak1-6B，以下均以此命名。（1）酶斑點印跡法。將剪裁好的NC膜在TBS中浸泡10 min，取出用濾紙吸干，備用。將Native和peak1-6B分調(diào)至5 g/L（0.01 mol/L TBST），分別取2 μL點樣于NC膜上，自然風(fēng)干。將膜浸泡于5%的脫脂奶，37℃封閉30 min。0.01 mol/L TBST洗膜3次。將2 μL1∶5(TBST)稀釋的5例不同sIgE效價（0.47、3.2、8.6、19、34 kU/L）蝦過敏患者血清和1例陰性對照血清作為一抗，分別點樣于包被好抗原的NC膜上，37℃反應(yīng)1 h。TBST洗3遍后，加入2 μL 250倍稀釋的兔抗人IgE-AP抗體，37℃溫育30 min。洗膜后加入AP底物顯色，觀察結(jié)果。（2）間接ELISA法。將Native和peak1-6B分別調(diào)整至50 mg/L（稀釋液0.1 mol/L pH7.4 PBS），每孔150 μL，37℃孵育2 h，4℃過夜，包被96孔微孔板。次日用洗液（0.01 mol/L pH7.4 TBST）洗滌5次。每孔加250 μL，2%PVA37℃溫育2 h，4℃過夜封閉，次日洗滌5次。分別加入1∶10稀釋（0.1 mol/L pH7.4PBS+2%Base）的陽性血清和陰性對照血清，37℃溫育1 h。洗板后加入1∶300稀釋的馬抗人IgE-HRP抗體，37℃溫育30 min后洗板。加入底物，避光顯色15 min，最終使用Biotek EXL-800酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值（A450）。

2 結(jié)果

2.1 Native中與蝦過敏患者血清sIgE結(jié)合的組分 Native組分的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖1a所示，至少有15條可辨認(rèn)的蛋白顯色條帶。Native免疫印跡結(jié)果可見陰性對照血清在33 ku處有較弱的顯色條帶，推測33 ku蛋白存在正常人的非特異性反應(yīng)。14例蝦過敏患者的血清sIgE主要和Native中大于55 ku的多種蛋白發(fā)生反應(yīng)。該處的顯色條帶較多，且有些條帶的顏色較深，見圖1b。

Figure 1 Results of components of Native protein and the effective sensitization component圖1 Native中蛋白組分以及有效致敏反應(yīng)組分分析結(jié)果

2.2 Sepharose 6B分離蝦有效致敏成分結(jié)果 蛋白檢測儀器檢測280 nm處發(fā)光蛋白層析圖譜，首先被洗脫的是大分子蛋白組分（peak1-6B），見圖2a。收集該組分，進(jìn)行peak1-6B的SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，peak1-6B中的主要成分為55 ku以上的大蛋白組分，而分離前37 ku和20 ku處含量相對較高的小分子蛋白被去除，見圖2b。

Figuer 2 Results of Atlas gel chromatography and the SDS-PAGE of peak1-6B圖2 凝膠層析分離圖譜(a)與peak1-6B的SDS-PAGE結(jié)果(b)

2.3 兩種蛋白溶液作為已知抗原檢測血清sIgE結(jié)果的比較 5例陽性患者和1例陰性對照血清的斑點印跡結(jié)果見圖3a。Image J軟件分析不同斑點的灰度值的點圖見圖3b?；颊哐逯衧IgE含量較低時，有peak1-6B作為抗原的檢測體系有較高的敏感度。間接ELISA法結(jié)果顯示：14例蝦過敏患者中，4號患者的Native作為包被抗原的A值高于peak1-6B組，其余13例患者血清以peak1-6B作為包被抗原的A值均高于Native組，見圖4。

3 討論

現(xiàn)今過敏原檢測試劑盒的抗原成分多是從食物中提取的包含全部蛋白組分的粗制品，但并不是所有的蛋白組分都是引起患者過敏的有效致敏原，這就導(dǎo)致了診斷試驗的假陰性結(jié)果[7]。蝦過敏原研究具有明顯的地域差異,2010年，Rahman研究小組使用質(zhì)譜分析技術(shù)證明了原肌球蛋白是黑虎蝦中的主要致敏蛋白[8]。天津食品生物技術(shù)重點實驗室研究結(jié)果顯示：凡納濱對蝦的主要過敏原為99、33、19、14 ku的蛋白質(zhì)組分；刀額新對蝦的主要過敏原為33 ku和24 ku的蛋白質(zhì)組分[9]。本研究顯示大于55 ku的蝦蛋白組分是和患者血清反應(yīng)的主要致敏成分，因此，提取與蝦過敏患者血清結(jié)合較強，但相對含量低的蛋白組分，以此作為血清sIgE檢測的已知抗原，必然會提高方法學(xué)的敏感度。本研究以55 ku為界，采用分子篩層析技術(shù)對蝦蛋白提取液進(jìn)行初步純化，從SDS-PAGE結(jié)果可以看出，應(yīng)用Sepha?rose 6B層析后，55 ku以上的大蛋白得到了初步的分離和濃縮，雖然沒有獲得純品蛋白，但從免疫化學(xué)角度看，本研究已經(jīng)獲得與待檢sIgE結(jié)合的大部分蛋白組分，可用于已知抗原檢測血清sIgE。

Figure 3 Results of dot blot analysis of peak1-6B圖3 peak1-6B斑點印跡分析結(jié)果

Figure 4 Comparison of the patient sIgE detected by indirect ELISA using two different antigens圖4 兩種抗原間接ELISA法檢測患者sIgE的比較

本研究選取了IgE效價由低到高的5例患者及1例健康對照的血清，進(jìn)行斑點印跡實驗結(jié)果顯示：當(dāng)過敏患者血清效價較低時（2、3、4號）peak1-6B組分斑點的灰度值明顯高于Native斑點的灰度值。而當(dāng)抗體效價增高時，兩種蛋白組分的灰度值差異減小。因此，筆者認(rèn)為，提取的peak1-6B組分可以在患者血清中sIgE含量較低時有效提高檢測敏感度。接下來，本研究使用間接ELISA法對14例蝦過敏患者血清進(jìn)行分析，結(jié)果4號患者的Native作為包被抗原的OD值高于peak1-6B作為檢測抗原的OD值。根據(jù)4號患者的免疫印跡結(jié)果，筆者推測，由于4號患者和蝦蛋白中小于55 ku的一些組分也有較強的反應(yīng)，因此使用Native包板的結(jié)果高于使用peak1-6B包板的結(jié)果，但此現(xiàn)象不具有普遍性。本研究提示，大部分蝦過敏患者血清sIgE結(jié)合的蝦蛋白組分主要集中在分子質(zhì)量較大的蛋白。蝦有效致敏成分作為檢測抗原能有效提高檢測結(jié)果的信號值，這對提高過敏原檢測的敏感度具有潛在意義。

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