姚 佳,王 昕,張建新,*,李賢良,郗存顯,王國民,王 雄,里 南,果 旗
(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.重慶出入境檢驗檢疫局,重慶 400020;3.北京中檢 維康技術(shù)有限公司,北京 100044)
免疫親和柱-高效液相色譜法測定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物
姚 佳1,王 昕1,張建新1,*,李賢良2,郗存顯2,王國民2,王 雄3,里 南3,果 旗3
(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.重慶出入境檢驗檢疫局,重慶 400020;3.北京中檢 維康技術(shù)有限公司,北京 100044)
建立免疫親和柱同時凈化-高效液相色譜法測定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物(α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮)殘留量的方法。樣品經(jīng)免疫親和柱凈化與富集后,用高效液相色譜-紫外檢測器檢測。采用Cloversil-C18反相柱分離,流動相為乙腈-甲醇-水溶液,檢測波長為265 nm。結(jié)果表明,牛奶中添加氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物的回收率在74%~101%,且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于7%。氯霉素的檢出限為0.02 μg/L,玉米赤霉醇及其類似物的檢出限分別為α-玉米赤霉醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉醇0.03 μg/L、α-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、玉米赤霉酮0.04 μg/L和玉米赤霉烯酮0.05 μg/L。該方法靈敏度高、重復(fù)性好,提高了檢測速率,可滿足牛奶樣品中痕量氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物殘留的測定。
牛奶;氯霉素;玉米赤霉醇;免疫親和柱;高效液相色譜
氯霉素(chloramphenicol,CAP)是一種高效廣譜的抗生素,在不同畜禽傳染性疾病的治療中應(yīng)用廣泛,若長期微量攝入CAP就會引起機(jī)體菌群失調(diào),還可導(dǎo)致再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病[1-3]。玉米赤霉醇(zearalanol,ZER)及其類似物能直接或間接作用于動物腦下垂體和胰臟,提高體內(nèi)生長激素和胰島素水平,加速機(jī)體蛋白質(zhì)的合成,提高飼料利用率,從而產(chǎn)生促進(jìn)增加增畜禽質(zhì)量的作用,曾作為生長促進(jìn)劑應(yīng)用于動物生長。常見主要有α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米
赤霉烯酮6 種。ZER在畜禽食品中的殘留直接影響人類健康,輕則引起人體性機(jī)能紊亂,重則影響第二性征的正常發(fā)育,甚至可引起癌癥[4]。1998年歐盟禁止將玉米赤霉醇等激素類藥物應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖;我國衛(wèi)生部在2010年明確將玉米赤霉醇列為非食用物質(zhì),我國也規(guī)定氯霉素和玉米赤霉醇在動物性食品中不得檢出[5-8]。
免疫親和柱(immunoaffinity column,IAC)是基于抗原抗體的具有高度親和性、專一性和可逆性,將特異性抗體固定在柱體內(nèi),選擇性吸附樣品中的待測物,雜質(zhì)不被吸附,流出柱外,柱上結(jié)合的待測物被特定的洗脫液洗脫下來,直接采用氣相色譜(gas chromatography,GC)、高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法、酶聯(lián)免疫反應(yīng)(enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA)等進(jìn)行含量測定的一種高效的前處理技術(shù)[9]。游麗娜[5]、李賢良[10]等分別比較了采用HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱和IAC對雞蛋樣品和豬肉樣品的凈化效果,以IAC對樣品的凈化效果最佳,雜質(zhì)干擾少,化合物響應(yīng)強(qiáng)度明顯提高,且無基質(zhì)效應(yīng)。目前有關(guān)檢測氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物的方法有GC、HPLC、ELISA等[11-17];樣品前處理凈化技術(shù)主要有液-液萃取和固-液萃取[18-20]。這些方法的主要缺陷是操作復(fù)雜、耗費大量有毒溶劑,專屬性差,且不能實現(xiàn)同時提取凈化和富集氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物的方法。本實驗采用免疫親和柱同時凈化和富集氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物,探討HPLC同時檢測氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物的色譜條件,建立免疫親和柱凈化-HPLC同時測定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物痕量殘留含量的方法,為不同食品殘留快速檢測提供參考依據(jù)。
1.1 材料與試劑
液態(tài)牛奶 市購;乙腈、甲醇(色譜純) 美國JT Baker公司;氯霉素(CAS:56-75-7)、α-玉米赤霉醇(CAS:26538-44-3)、β-玉米赤霉醇(CAS:26538-44-3)、α-玉米赤霉烯醇(CAS:36455-72-8)、β-玉米赤霉烯醇(CAS:36455-72-8)、玉米赤霉酮(CAS:5975-78-0)和玉米赤霉烯酮(CAS:17924-92-4)標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于99%) 美國Sigma公司。
1.2 儀器與設(shè)備
C18色譜柱、IAC-CZ免疫親和柱(對氯霉素的柱容量為100 ng,對玉米赤霉醇及其類似物的柱容量為500 ng)北京中檢維康技術(shù)有限公司;LC-10A高效液相色譜系統(tǒng)(配可變波長的紫外檢測器) 日本島津公司;DT5-1臺式離心機(jī) 北京時代北利離心機(jī)有限公司;DCY-125氮吹儀 青島海科儀器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液
CAP標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:準(zhǔn)確稱取10 mg CAP標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中,用甲醇定容至容量瓶刻度,搖勻,配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,轉(zhuǎn)移至棕色瓶中,貼上標(biāo)簽。ZER單種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:分別稱取適量的玉米赤霉醇及其類似物標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇稀釋配成100 mg/L的單種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。ZER混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:分別移取適量ZER單種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用甲醇稀釋成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液均于4 ℃條件下保存,保存期限6個月。
1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液
CAP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:根據(jù)需要用甲醇將CAP標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液;ZER混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:根據(jù)需要用甲醇將ZER混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均于4 ℃條件下保存。
1.3.2 樣品的測定
取60 mL牛奶樣品于4 000 r/min條件下離心10 min,取50 mL下層溶液以2 mL/min的流速通過免疫親和柱,待溶液全部流出后,用10 mL純水以2~3 mL/min的流速淋洗親和柱,將雜質(zhì)洗去。待溶液全部流出親和柱后,將玻璃小管置于親和柱下,用2 mL甲醇以2 mL/min的流速將親和柱中的氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物洗脫下來,所得樣品洗脫液收集于玻璃測試管中,于50℃氮氣條件下吹至近干,然后用流動相定容至500 μL,注入HPLC儀中進(jìn)行分析。
1.3.3 色譜條件
色譜柱:Cloversil ODS-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈-甲醇-水(40∶5∶55,V/V)溶液;流速1.0 mL/min;柱溫為室溫;檢測器:紫外檢測波長265 nm;進(jìn)樣量20 μL。
2.1 色譜條件選擇
氯霉素和玉米赤霉醇均可用液相色譜-紫外檢測器來進(jìn)行檢測,且兩者的檢測波長相近(氯霉素檢測波長278 nm,玉米赤霉醇檢測波長265 nm)。選用265 nm作為檢測波長進(jìn)行檢測,包括氯霉素和玉米赤霉醇6 種類似物在內(nèi)的7 種物質(zhì)均可被檢測到,且分離度較好。
分析氯霉素或玉米赤霉醇常用的有機(jī)流動相有甲醇或乙腈,水相流動相為純水或弱酸(如甲酸或乙酸)水溶液。分析氯霉素常用的流動相多為甲醇-水,分析玉米赤霉醇常用的流動相多為乙腈-水。使用乙腈-水
(40∶60,V/V)溶液作為流動相同時分離氯霉素和6 種玉米赤霉醇及其類似物,可實現(xiàn)基線分離,但整個分析過程需40 min左右;使用乙腈-甲醇-水(40∶5∶55,V/V)溶液作為流動相進(jìn)行分離,不同物質(zhì)之間的分離度很好,可獲得良好的分離度和峰形,整個分析過程需30 min左右,縮短了分析時間,提高了分析效率,質(zhì)量濃度100 μg/L的氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。從圖1可知,色譜峰峰形尖銳,對稱性好,表明選擇的色譜條件可滿足分析測定需要。
圖1 氯霉素和玉米赤霉醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖 (100 μg/L)Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of CAP and ZER (100 μg/L)
2.2 樣品前處理方法的選擇
測定牛奶中氯霉素或玉米赤霉醇常用方法為用乙腈或乙酸乙酯溶劑提取[10,21-25],但用有機(jī)溶劑提取牛奶中的氯霉素和玉米赤霉醇時二者不能同時兼顧,且用有機(jī)溶劑進(jìn)行液-液萃取或固-液萃取操作相對比較步驟繁瑣,且費時、費力,影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。
本實驗采用牛奶樣品直接通過免疫親和柱進(jìn)行凈化(未出現(xiàn)篩板堵塞現(xiàn)象)的方法,簡化了操作步驟,減小了繁瑣操作引起的誤差,同時避免了使用有機(jī)試劑,降低了對環(huán)境和人體帶來的危害,達(dá)到了滿意的凈化效果,實現(xiàn)了牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物的同時凈化與富集。
圖2 牛奶樣品添加氯霉素和玉米赤霉醇的色譜圖(質(zhì)量濃度11 μg/L)Fig.2 Chromatogram of milk spiked with mixed standard solution of CAP and ZER (1 μg/L)
由圖2可知,在優(yōu)化的色譜條件下,色譜峰峰形較佳,且無雜質(zhì)干擾,能滿足氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物的同時檢測要求。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限
分別配制5、10、20、50、100、200、500 μg/L的氯霉素與玉米赤霉醇及其類似物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在確定的色譜條件下進(jìn)行測定,以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表1。
表1 混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 1 Linear equations, correlation coefficients and detection limits for seven compounds
以基線噪聲3 倍峰面積對應(yīng)的7 種毒素的含量作為檢出限的規(guī)則(RSN=3),得到氯霉素的檢出限為0.02 μg/L,玉米赤霉醇及其類似物的檢出限分別為α-玉米赤霉醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉醇0.03 μg/L、α-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、玉米赤霉酮0.04 μg/L、玉米赤霉烯酮0.05 μg/L。
2.4 精密度
取不含氯霉素和玉米赤霉醇的牛奶樣品按照氯霉素1.00 μg/L,玉米赤霉醇及其類似物各2.00 μg/L進(jìn)行添加,按實驗方法連續(xù)測定5 次。計算得到上述樣品中氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物的含量,見表2。
表2 牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=5)Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) for milk spiked with CAP and ZER (n=5)
從表2可以看出,本方法測定氯霉素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.82%;測定6 種玉米赤霉醇及其類似物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在均6.70%以內(nèi),基本滿足了定量檢測對相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求。
2.5 準(zhǔn)確性
取不含氯霉素和玉米赤霉醇的牛奶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗(三水平添加),結(jié)果見表3。
表3 牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇回收率Table 3 Recoveries for milk spiked with CAP and ZER
由表3可知,氯霉素的回收率在93%~100%之間,玉米赤霉醇及其類似物回收率在74%~101%之間,說明該方法的準(zhǔn)確性良好,能夠滿足同時測定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇類化合物痕量殘留的要求。
建立牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物共7 種禁用藥殘留量同時測定的HPLC法。免疫親和柱作為樣品前處理的方法是利用抗原抗體的高度特異性來進(jìn)行樣品的分離純化與富集的,因此能有效的將干擾物除去。免疫親和柱的應(yīng)用簡化了牛奶樣品前處理的提取、濃縮等操作步驟,同時減少使用有機(jī)試劑,降低了對環(huán)境和人體帶來的危害,實現(xiàn)了牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物的同時凈化與富集。
免疫親和柱-HPLC測定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其類似物方法的檢出限分別為氯霉素0.02 μg/L、α-玉米赤霉醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉醇0.03 μg/L、α-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、玉米赤霉酮0.04 μg/L和玉米赤霉烯酮0.05 μg/L。方法的回收率(74%~101%)及重復(fù)性(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7%)等技術(shù)指標(biāo)均滿足國內(nèi)外相關(guān)要求。該方法的檢出限滿足國內(nèi)外對上述7 種禁用藥物的監(jiān)控和檢測要求,可用于牛奶中這7 種禁用藥痕量殘留的檢測。免疫親和柱其獨特的專一性、高富集率和良好的凈化效能,能顯著提高檢測靈敏度和分析方法的穩(wěn)定性,且提高了分析效率,應(yīng)用前景廣闊。
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Simultaneous Determination of Residues of Chloramphenicol, Zearalanol and Its Analogs in Milk by High Performance Liquid Chromatography with Immunoaffinity Column
YAO Jia1, WANG Xin1, ZHANG Jian-xin1,*, LI Xian-liang2, XI Cun-xian2, WANG Guo-min2, WANG Xiong3, LI Nan3, GUO Qi3
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China; 2. Chongqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Chongqing 400020, China; 3. Clover Technology Group Inc., Beijing 100044, China)
An immunoaffinity column cleanup-high performance liquid chromatography (HPLC) method was established for the simultaneous determination of residues of chloramphenicol, zearalanol and its analogs (α-zeranol, β-zeranol, α-zearalenol, β-zearalenol, zearalanone, and zearalenone) in milk. Samples were cleaned up and enriched on an immunoaffinity column. The chromatographic separation was performed on a Cloversil-C18column using acetonitrile-methanol-water as the mobile phase and ultraviolet (UV) detection was performed at 265 nm. The recoveries of seven target compounds at different spiked levels ranged from 74% to 101% and the relative standard deviations were less than 7%. The limits of detection were 0.02 μg/L for chloramphenicol, 0.03 μg/L for α-zearalanol, β-zearalanol, α-zearalenol, and β-zearalenol, 0.04 μg/L for zearalanone, and 0.05 μg/L for zearalenone. The proposed method is efficient, stable, reliable and accurate, and can be used for the determination of trace residues of chloramphenicol, zearalanol and its analogs in milk.
milk; chloramphenicol; zearalanol; immunoaffinity column; high performance liquid chromatography (HPLC)
TS207.5;R155.5
A
1002-6630(2014)18-0124-04
10.7506/spkx1002-6630-201418025
2014-01-03
國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫局公益性行業(yè)科研專項(201210086)
姚佳(1990—),女,碩士研究生,主要從事食品安全檢測技術(shù)研究。E-mail:yaojia083@163.com
*通信作者:張建新(1959—),男,教授,碩士,主要從事食品營養(yǎng)安全與標(biāo)準(zhǔn)化研究。E-mail:zhangjx59@foxmail.com