響應(yīng)面法優(yōu)化二色補血草多糖的乙?；に?/h1>
2014-02-27 08:39:38張婷婷唐志書張麗華
食品科學(xué) 2014年18期
趙 鵬，宋 逍，張婷婷，唐志書，張麗華
（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046）
響應(yīng)面法優(yōu)化二色補血草多糖的乙?；に?/p>
趙 鵬，宋 逍，張婷婷，唐志書，張麗華
（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046）
采用響應(yīng)面試驗研究合成乙酰化二色補血草多糖的最優(yōu)工藝條件，以乙酰化多糖取代度為評價指標(biāo)，考察反應(yīng)時間、乙酸酐與多糖的物質(zhì)的量比和反應(yīng)溫度對乙?；嗵侨〈鹊挠绊憽＝Y(jié)果表明，通過響應(yīng)面試驗得到的最優(yōu)工藝條件為：反應(yīng)時間2.6 h、乙酸酐與多糖的物質(zhì)的量比3.3∶1、反應(yīng)溫度65 ℃。在此條件下，二色補血草乙?；嗵侨〈葹?.409。初步的抗氧化性實驗表明，乙酰化后的二色補血草多糖的抗氧化性能有了明顯提高。
二色補血草；多糖；乙?；?；響應(yīng)面；抗氧化性
二色補血草（Limonium bicolor Kunze）是常用中藥，屬于白花丹科補血草屬植物。其主要生長于我國陜西、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等地[1]。二色補血草具有溫中健脾、滋補強壯、補血、止血等功效，臨床上主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、功血、宮頸癌等癥[2-8]。研究表明，二色補血草多糖是二色補血草中的主要活性成分之一，具有抗氧化，抗腫瘤等生物活性[9]。目前對于二色補血草多糖的研究主要集中其分離純化、藥理活性等方面，而對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行衍生化方面的研究尚未見報道。
對于多糖進(jìn)行衍生化的方法主要包括物理法、化學(xué)法及生物法等。利用化學(xué)的方法對多糖的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，能夠提高其生物活性，甚至賦予其新的生物活性。因此，對于多糖的衍生化研究已成為多糖研究者重點關(guān)注的熱點[10-15]。而對多糖的乙酰化修飾是對多糖進(jìn)行衍生化的重要途徑之一，乙酰化后的多糖在溶解性、生物活性等方面均有了明顯的改善[16-19]。
基于上述原因，本研究在前期對二色補血草多糖分離純化的研究基礎(chǔ)之上，利用響應(yīng)面試驗對二色補血草多糖乙酰化修飾的合成工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，并初步研究了乙酰化后多糖的抗氧化性，考察乙?；揎棇Χa血草多糖抗氧化活性的影響。本研究成果進(jìn)一步拓寬了二色補血草這一藥用資源的利用途徑，對其作為功能性食品添加劑的研究和開發(fā)利用提供了一定的技術(shù)參考。
1 材料與方法
1.1 材料、試劑與儀器
二色補血草購自西安萬壽路中藥材批發(fā)市場。
乙酸酐、鹽酸羥胺、乙醇、乙醚、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚、鄰二氮菲、三羥甲基氨基甲烷、β-D-五乙酰葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
UV-2501PC紫外-可見分光光度儀 日本島津公司；FA2004電子天平 上海精科天平廠；H2050R臺式離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；ALPHA1-4型真空冷凍干燥機 德國Christ公司。
1.2 方法
1.2.1 二色補血草多糖的制備
將二色補血草在80 ℃條件下干燥，粉碎后過60 目篩。再將其用無水乙醇在回流下脫脂2 次，過濾，濾渣晾干后，用雙蒸水，按料液比1∶15（g/mL）80 ℃條件下提取2 次，提取液合并，再按1 g生藥材濃縮為1 mL進(jìn)行濃縮，濃縮液經(jīng)脫蛋白、脫色處理后醇沉，即得二色補血草粗多糖，用水復(fù)溶后，再用Sephadex G-100凝膠柱進(jìn)行純化，收集多糖富集峰，濃縮后凍干即得二色補血草多糖，經(jīng)測定該多糖含量為98.4%，經(jīng)高效凝膠色譜法檢測，其為均一多糖，相對分子質(zhì)量為14 000。
1.2.2 二色補血草多糖的乙?；に嚄l件優(yōu)化
參照文獻(xiàn)[16-18]的方法，先精確稱取一定量的多糖樣品，加入適量雙蒸水將其溶解，利用氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值在9.0左右，在一定溫度條件下，往多糖溶液滴加一定量的乙酸酐。滴加完畢后，恒溫反應(yīng)一段時間后，待反應(yīng)結(jié)束，再用鹽酸溶液將反應(yīng)液調(diào)為中性。將反應(yīng)液裝入截留相對分子質(zhì)量為3 500的透析袋中用流動水透析48 h。透析液濃縮后即得乙?；揎椀亩a血草多糖。
本研究按照Box-Behnken試驗設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)之上，以乙酰化多糖取代度作為指標(biāo)，選取反應(yīng)時間、配料比（乙酸酐與多糖的物質(zhì)的量比）和反應(yīng)溫度單因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗，優(yōu)化二色補血草多糖乙?；墓に嚄l件。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。
表1 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Coded levels for independent variables used in response surface dessiiggnn
1.2.3 二色補血草乙?；嗵侨〈鹊臏y定
1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
參照文獻(xiàn)[19]測定乙?；嗵堑娜〈取?zhǔn)確稱取β-D-五乙酰葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.500 6 g，定容于100 mL容量瓶。標(biāo)準(zhǔn)溶液中乙酰基質(zhì)量濃度為2.760 mg/mL。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、4、6、8、10、12 mL，分別置于50 mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入0.1 mol/L新配的鹽酸羥胺溶液5 mL，加入1.5 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，靜置20 min后，加入2 mol/L鹽酸溶液3.5 mL中和過量堿，再靜置20 min，加入0.37 mol/L三氯化鐵顯色劑10 mL，用水定容，靜置10 min，于波長500 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，乙酰基質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制乙?；鶚?biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：y = 1.985x-0.029，R2=0.999 7，在0.10～0.70 mg/mL范圍內(nèi)，乙?；|(zhì)量濃度與吸光度線性良好。
1.2.3.2 乙?；瘶悠啡〈鹊臏y定
配制乙?；昂鸵阴；髽悠啡芤海_吸取樣品溶液，按1.2.3.1節(jié)中的方法，在波長500 nm處測定吸光度A1和A2，然后按照乙?；康木€性回歸方程，計算樣品中的乙?；?。
乙?；嗵堑娜〈潭扔酶男院蟮亩嗵侵幸阴；暮浚ˋc）表示。乙?；嗵堑某潭扔萌〈龋―s）表示，計算如下：
1.2.4 抗氧化性能測試
參照文獻(xiàn)[20]測試樣品對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除效果。
2 結(jié)果與分析
2.1 二色補血草多糖乙?；暮铣?/p>
2.1.1 單因素對乙?；嗵侨〈鹊挠绊?/p>
2.1.1.1 反應(yīng)時間的影響
圖1 反應(yīng)時間對乙?；嗵侨〈鹊挠绊慒ig.1 Effect of reaction time on the DSof acetylated polysaccharides
預(yù)設(shè)反應(yīng)溫度50 ℃，配料比（乙酸酐與多糖的物質(zhì)的量比）2∶1，確定最優(yōu)的反應(yīng)時間，結(jié)果見圖1。圖1說明，當(dāng)反應(yīng)時間為3.0 h以上時，乙酰化多糖取代度的值基本不再改變，因此確定最優(yōu)的反應(yīng)時間為
3.0 h。
2.1.1.2 配料比的影響
圖2 配料比對乙酰化多糖取代度的影響Fig.2 Effect of ratio of acetic anhydride to polysaccharide on the DSof acetylated polysaccharides
預(yù)設(shè)反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時間3.0 h，改變配料比，確定最優(yōu)的配料比（乙酸酐與多糖的物質(zhì)的量比），結(jié)果見圖2。
由圖2可知，當(dāng)配料比為3∶1左右時，乙?；嗵侨〈鹊闹颠_(dá)到最大，因此確定最優(yōu)的配料比為3∶1左右。
2.1.1.3 反應(yīng)溫度的影響
預(yù)設(shè)反應(yīng)時間3.0 h、配料比（乙酸酐與多糖的物質(zhì)的量比）3.0，確定最優(yōu)的反應(yīng)溫度，結(jié)果見圖3。
圖3 反應(yīng)溫度對乙?；嗵侨〈鹊挠绊慒ig.3 Effect of reaction temperature on the DSof acetylated polysaccharides
圖3說明，當(dāng)反應(yīng)溫度到60 ℃左右時，乙?；嗵侨〈鹊闹禐樽畲?，因此確定最優(yōu)的反應(yīng)溫度為60 ℃左右。
2.1.2 二色補血草多糖乙?；揎椆に嚄l件優(yōu)化
表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The experimental design and results for response surface analysis
采用Design-Expert 7.01軟件對響應(yīng)面優(yōu)化試驗得到的結(jié)果進(jìn)行分析研究，試驗結(jié)果見表2，按照各因素對試驗結(jié)果的影響進(jìn)行二次方程擬合，擬合得到以下方程：
表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance for the results of response surface design
由表3的分析結(jié)果可以看出，回歸方程的F值為38.56，其顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.05，這說明利用響應(yīng)面法擬合得到的試驗?zāi)Ｐ惋@著性極高，按照擬合模型得到的回歸方程，考察其因變量與自變量之間的線性相關(guān)系數(shù)后發(fā)現(xiàn)，r= 0.035/0.036 =0.972 2，這一點表明用該數(shù)學(xué)模型來評估各相關(guān)因素對二色補血草多糖乙?；〈鹊挠绊懴鄬?zhǔn)確。對表3的方差分析結(jié)果可以看出，響應(yīng)面試驗組合的各單因素中，對二色補血草乙?；嗵侨〈鹊挠绊懽畲蟮氖欠磻?yīng)溫度，其次是配料比，反應(yīng)時間的影響最小，但上述3 個因素均為顯著影響因素，交互影響因素中，反應(yīng)時間與反應(yīng)溫度之間的交互影響最為顯著，為顯著影響因素。
2.1.3 響應(yīng)面圖分析
圖4 兩兩因素交互作用對乙?；嗵侨〈鹊挠绊慒ig.4 Interactive effects of three factors on the DSof acetylated polysaccharides
通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗分析得到相應(yīng)的響應(yīng)面圖，可以更加直觀地反映出各單因素對二色補血草乙?；嗵侨〈鹊挠绊懡Y(jié)果以及各單因素之間交互影響的強弱關(guān)系。響應(yīng)面試驗得到的等高線圖見圖4。
由圖4可知，反應(yīng)溫度對二色補血草乙?；嗵侨〈鹊挠绊憳O為顯著，可看出其繪制的曲線最為陡峭；配料比對乙?；嗵侨〈鹊挠绊懘沃?，而影響最小的則是反應(yīng)時間，相較于反應(yīng)溫度而言，其曲線較為平滑一些。通過響應(yīng)面法預(yù)測得到的回歸模型分析[21-24]，可預(yù)測得到二色補血草多糖乙酰化的最優(yōu)合成工藝條件為反應(yīng)時間2.57 h、配料比3.26∶1、反應(yīng)溫度65.5 ℃，在預(yù)測的工藝條件下，得到的乙?；嗵堑娜〈葹?.413。
2.1.4 驗證實驗
按照上述預(yù)測的結(jié)果，從實驗操作的可操作性考慮，微調(diào)上述工藝條件為：反應(yīng)時間2.6 h、配料比3.3∶1、反應(yīng)溫度65 ℃。分別用0.1 g的二色補血草多糖，在微調(diào)后的乙?；揎椀墓に嚄l件下，做3 次多糖乙?；叫袑嶒?，得到的乙酰化二色補血草多糖乙?；〈鹊钠骄禐?.409，實驗結(jié)果表明，通過回歸方程預(yù)測得到的工藝條件與實際操作工藝條件十分吻合。
2.2 二色補血草乙?；嗵堑某醪浇Y(jié)構(gòu)分析
2.2.1 紅外光譜
分別將二色補血草多糖、二色補血草乙?；嗵呛弯寤浹心浩螅t外光譜儀進(jìn)行測定。結(jié)果如圖5所示。
圖5 二色補血草多糖（A）和二色補血草乙?；嗵牵˙）的紅外光譜圖Fig.5 IR spectra of native (A) and acetylated (B) Limonium bicolor polysaccharides
由圖5可見，經(jīng)過乙酰化后的二色補血草多糖的紅外譜圖，在1 733 cm-1出現(xiàn)了酯基的C=O伸縮振動，1 247 cm-1處有一個較弱的酯基的C—O伸縮振動，這表明存在乙酰基[25]。OH伸縮振動強度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于C—O伸縮振動，這說明乙酰化樣品的取代度并不是太高，這一點通過羥胺比色法已經(jīng)被證明。此外，從圖5還可以看出，兩圖的紅外吸收光譜非常接近，這說明乙酰化修飾并未改變二色補血草多糖的大體結(jié)構(gòu)。
2.2.2 紫外光譜
圖6 樣品的紫外吸收光譜圖Fig.6 Ultraviolet absorption spectra of native and acetylated Limonium bicolor polysaccharides
由圖6可知，乙?；昂蟮亩a血草多糖在200～480 nm波段的紫外光譜比較相似，但是根據(jù)UV2501PC 隨機軟件分析發(fā)現(xiàn)，乙酰化后的多糖在252～272 nm波長處存在一個弱的吸收峰，這可能是由于羰基產(chǎn)生的。
通過紅外和紫外譜圖分析可知，本研究已經(jīng)成功制備得到了二色補血草乙?；嗵恰?/p>
2.3 二色補血草乙?；嗵堑目寡趸钚?/p>
2.3.1 羥自由基清除率
由圖7可知，經(jīng)過乙?；揎椇蟮亩a血草多糖清除羥自由基的最大清除率為69.2%，比乙?；岸嗵堑淖畲笄宄?6.3%提高了22.9%，清除羥自由基的能力有了明顯的提高。
圖7 二色補血草乙?；嗵菍αu自由基的清除作用Fig.7 Hydroxyl radical scavenging capacity of native and acetylated Limonium bicolor polysaccharides
2.3.2 超氧陰離子自由基清除率
圖8 二色補血草乙酰化多糖對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.8 Superoxide anion radical scavenging capacity of native and acetylated Limonium bicolor polysaccharides
由圖8可知，經(jīng)過乙?；揎椇蟮亩a血草多糖清除超氧陰離子自由基的最大清除率為81.3%，比乙?；岸嗵堑淖畲笄宄?5.2%提高了24.7%，清除超氧陰離子自由基的能力也有了明顯的提高。
抗氧化性實驗結(jié)果說明，乙?；揎椂a血草多糖，可有效地提高其抗氧化活性。
3 結(jié) 論
本研究對二色補血草多糖進(jìn)行乙?；揎椀墓に嚶肪€進(jìn)行研究，并通過響應(yīng)面試驗分析方法優(yōu)化了其最優(yōu)的修飾工藝條件為反應(yīng)時間2.6 h、配料比3.3∶1、反應(yīng)溫度65 ℃，在此條件下修飾制得的二色補血草乙?；嗵堑囊阴；〈葹?.409。利用該方法對多糖進(jìn)行乙?；揎?，具有反應(yīng)可操作性強、試劑便宜易得、多糖的乙酰化取代度較高的優(yōu)點，是一種較理想的多糖乙?；揎椃椒?。通過二色補血草多糖乙?；苌锍蹶庪x子自由基和羥自由基的清除實驗表明，經(jīng)過乙酰化修飾后的抗氧化能力較之乙?；揎椙暗亩嗵怯辛朔浅Ｃ黠@的改善，其抗氧化能力進(jìn)一步增強。
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Optimization of Acetylation Process for Polysaccharides from Limonium bicolor Kunze
ZHAO Peng, SONG Xiao, ZHANG Ting-ting, TANG Zhi-shu, ZHANG Li-hua
(School of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)
In this study, response surface methodology was employed to optimize the acetylation conditions of polysaccharides from Limonium bicolor Kunze. The degree of substitution (Ds) of acetylated polysaccharides was investigated as a function of reaction time, molar ratio of acetic anhydride to polysaccharides, and reaction temperature. The optimal conditions for acetylating polysaccharides from Limonium bicolor Kunze were found to be reaction at 65 ℃ for 2.6 h with an acetic anhydride-to-polysaccharide ratio of 3.3:1. The maximum DS of 0.409 was obtained under the optimized reaction conditions. Antioxidant assays demonstrated that compared with Limonium bicolor Kunze polysaccharides, the antioxidant capacity of acetylated derivatives was significantly improved.
Limonium bicolor Kunze; polysaccharides; acetylation; response surface methodology; antioxidant capacity
TS272
A
1002-6630（2014）18-0052-05
10.7506/spkx1002-6630-201418010
2014-04-11
陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2012K19-04-07）；陜西省教育廳專項科研計劃項目（2010JK521）
趙鵬（1977—），男，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物分離純化及修飾。E-mail：zhaopeng65@sina.com
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趙 鵬，宋 逍，張婷婷，唐志書，張麗華
（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046）
響應(yīng)面法優(yōu)化二色補血草多糖的乙?；に?/p>
趙 鵬，宋 逍，張婷婷，唐志書，張麗華
（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046）
采用響應(yīng)面試驗研究合成乙酰化二色補血草多糖的最優(yōu)工藝條件，以乙酰化多糖取代度為評價指標(biāo)，考察反應(yīng)時間、乙酸酐與多糖的物質(zhì)的量比和反應(yīng)溫度對乙?；嗵侨〈鹊挠绊憽＝Y(jié)果表明，通過響應(yīng)面試驗得到的最優(yōu)工藝條件為：反應(yīng)時間2.6 h、乙酸酐與多糖的物質(zhì)的量比3.3∶1、反應(yīng)溫度65 ℃。在此條件下，二色補血草乙?；嗵侨〈葹?.409。初步的抗氧化性實驗表明，乙酰化后的二色補血草多糖的抗氧化性能有了明顯提高。
二色補血草；多糖；乙?；?；響應(yīng)面；抗氧化性
二色補血草（Limonium bicolor Kunze）是常用中藥，屬于白花丹科補血草屬植物。其主要生長于我國陜西、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等地[1]。二色補血草具有溫中健脾、滋補強壯、補血、止血等功效，臨床上主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、功血、宮頸癌等癥[2-8]。研究表明，二色補血草多糖是二色補血草中的主要活性成分之一，具有抗氧化，抗腫瘤等生物活性[9]。目前對于二色補血草多糖的研究主要集中其分離純化、藥理活性等方面，而對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行衍生化方面的研究尚未見報道。
對于多糖進(jìn)行衍生化的方法主要包括物理法、化學(xué)法及生物法等。利用化學(xué)的方法對多糖的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，能夠提高其生物活性，甚至賦予其新的生物活性。因此，對于多糖的衍生化研究已成為多糖研究者重點關(guān)注的熱點[10-15]。而對多糖的乙酰化修飾是對多糖進(jìn)行衍生化的重要途徑之一，乙酰化后的多糖在溶解性、生物活性等方面均有了明顯的改善[16-19]。
基于上述原因，本研究在前期對二色補血草多糖分離純化的研究基礎(chǔ)之上，利用響應(yīng)面試驗對二色補血草多糖乙酰化修飾的合成工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，并初步研究了乙酰化后多糖的抗氧化性，考察乙?；揎棇Χa血草多糖抗氧化活性的影響。本研究成果進(jìn)一步拓寬了二色補血草這一藥用資源的利用途徑，對其作為功能性食品添加劑的研究和開發(fā)利用提供了一定的技術(shù)參考。
1 材料與方法
1.1 材料、試劑與儀器
二色補血草購自西安萬壽路中藥材批發(fā)市場。
乙酸酐、鹽酸羥胺、乙醇、乙醚、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚、鄰二氮菲、三羥甲基氨基甲烷、β-D-五乙酰葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
UV-2501PC紫外-可見分光光度儀 日本島津公司；FA2004電子天平 上海精科天平廠；H2050R臺式離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；ALPHA1-4型真空冷凍干燥機 德國Christ公司。
1.2 方法
1.2.1 二色補血草多糖的制備
將二色補血草在80 ℃條件下干燥，粉碎后過60 目篩。再將其用無水乙醇在回流下脫脂2 次，過濾，濾渣晾干后，用雙蒸水，按料液比1∶15（g/mL）80 ℃條件下提取2 次，提取液合并，再按1 g生藥材濃縮為1 mL進(jìn)行濃縮，濃縮液經(jīng)脫蛋白、脫色處理后醇沉，即得二色補血草粗多糖，用水復(fù)溶后，再用Sephadex G-100凝膠柱進(jìn)行純化，收集多糖富集峰，濃縮后凍干即得二色補血草多糖，經(jīng)測定該多糖含量為98.4%，經(jīng)高效凝膠色譜法檢測，其為均一多糖，相對分子質(zhì)量為14 000。
1.2.2 二色補血草多糖的乙?；に嚄l件優(yōu)化
參照文獻(xiàn)[16-18]的方法，先精確稱取一定量的多糖樣品，加入適量雙蒸水將其溶解，利用氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值在9.0左右，在一定溫度條件下，往多糖溶液滴加一定量的乙酸酐。滴加完畢后，恒溫反應(yīng)一段時間后，待反應(yīng)結(jié)束，再用鹽酸溶液將反應(yīng)液調(diào)為中性。將反應(yīng)液裝入截留相對分子質(zhì)量為3 500的透析袋中用流動水透析48 h。透析液濃縮后即得乙?；揎椀亩a血草多糖。
本研究按照Box-Behnken試驗設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)之上，以乙酰化多糖取代度作為指標(biāo)，選取反應(yīng)時間、配料比（乙酸酐與多糖的物質(zhì)的量比）和反應(yīng)溫度單因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗，優(yōu)化二色補血草多糖乙?；墓に嚄l件。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。
表1 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Coded levels for independent variables used in response surface dessiiggnn
1.2.3 二色補血草乙?；嗵侨〈鹊臏y定
1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
參照文獻(xiàn)[19]測定乙?；嗵堑娜〈取?zhǔn)確稱取β-D-五乙酰葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.500 6 g，定容于100 mL容量瓶。標(biāo)準(zhǔn)溶液中乙酰基質(zhì)量濃度為2.760 mg/mL。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、4、6、8、10、12 mL，分別置于50 mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入0.1 mol/L新配的鹽酸羥胺溶液5 mL，加入1.5 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，靜置20 min后，加入2 mol/L鹽酸溶液3.5 mL中和過量堿，再靜置20 min，加入0.37 mol/L三氯化鐵顯色劑10 mL，用水定容，靜置10 min，于波長500 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，乙酰基質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制乙?；鶚?biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：y = 1.985x-0.029，R2=0.999 7，在0.10～0.70 mg/mL范圍內(nèi)，乙?；|(zhì)量濃度與吸光度線性良好。
1.2.3.2 乙?；瘶悠啡〈鹊臏y定
配制乙?；昂鸵阴；髽悠啡芤海_吸取樣品溶液，按1.2.3.1節(jié)中的方法，在波長500 nm處測定吸光度A1和A2，然后按照乙?；康木€性回歸方程，計算樣品中的乙?；?。
乙?；嗵堑娜〈潭扔酶男院蟮亩嗵侵幸阴；暮浚ˋc）表示。乙?；嗵堑某潭扔萌〈龋―s）表示，計算如下：
1.2.4 抗氧化性能測試
參照文獻(xiàn)[20]測試樣品對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除效果。
2 結(jié)果與分析
2.1 二色補血草多糖乙?；暮铣?/p>
2.1.1 單因素對乙?；嗵侨〈鹊挠绊?/p>
2.1.1.1 反應(yīng)時間的影響
圖1 反應(yīng)時間對乙?；嗵侨〈鹊挠绊慒ig.1 Effect of reaction time on the DSof acetylated polysaccharides
預(yù)設(shè)反應(yīng)溫度50 ℃，配料比（乙酸酐與多糖的物質(zhì)的量比）2∶1，確定最優(yōu)的反應(yīng)時間，結(jié)果見圖1。圖1說明，當(dāng)反應(yīng)時間為3.0 h以上時，乙酰化多糖取代度的值基本不再改變，因此確定最優(yōu)的反應(yīng)時間為
3.0 h。
2.1.1.2 配料比的影響
圖2 配料比對乙酰化多糖取代度的影響Fig.2 Effect of ratio of acetic anhydride to polysaccharide on the DSof acetylated polysaccharides
預(yù)設(shè)反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時間3.0 h，改變配料比，確定最優(yōu)的配料比（乙酸酐與多糖的物質(zhì)的量比），結(jié)果見圖2。
由圖2可知，當(dāng)配料比為3∶1左右時，乙?；嗵侨〈鹊闹颠_(dá)到最大，因此確定最優(yōu)的配料比為3∶1左右。
2.1.1.3 反應(yīng)溫度的影響
預(yù)設(shè)反應(yīng)時間3.0 h、配料比（乙酸酐與多糖的物質(zhì)的量比）3.0，確定最優(yōu)的反應(yīng)溫度，結(jié)果見圖3。
圖3 反應(yīng)溫度對乙?；嗵侨〈鹊挠绊慒ig.3 Effect of reaction temperature on the DSof acetylated polysaccharides
圖3說明，當(dāng)反應(yīng)溫度到60 ℃左右時，乙?；嗵侨〈鹊闹禐樽畲?，因此確定最優(yōu)的反應(yīng)溫度為60 ℃左右。
2.1.2 二色補血草多糖乙?；揎椆に嚄l件優(yōu)化
表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The experimental design and results for response surface analysis
采用Design-Expert 7.01軟件對響應(yīng)面優(yōu)化試驗得到的結(jié)果進(jìn)行分析研究，試驗結(jié)果見表2，按照各因素對試驗結(jié)果的影響進(jìn)行二次方程擬合，擬合得到以下方程：
表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance for the results of response surface design
由表3的分析結(jié)果可以看出，回歸方程的F值為38.56，其顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.05，這說明利用響應(yīng)面法擬合得到的試驗?zāi)Ｐ惋@著性極高，按照擬合模型得到的回歸方程，考察其因變量與自變量之間的線性相關(guān)系數(shù)后發(fā)現(xiàn)，r= 0.035/0.036 =0.972 2，這一點表明用該數(shù)學(xué)模型來評估各相關(guān)因素對二色補血草多糖乙?；〈鹊挠绊懴鄬?zhǔn)確。對表3的方差分析結(jié)果可以看出，響應(yīng)面試驗組合的各單因素中，對二色補血草乙?；嗵侨〈鹊挠绊懽畲蟮氖欠磻?yīng)溫度，其次是配料比，反應(yīng)時間的影響最小，但上述3 個因素均為顯著影響因素，交互影響因素中，反應(yīng)時間與反應(yīng)溫度之間的交互影響最為顯著，為顯著影響因素。
2.1.3 響應(yīng)面圖分析
圖4 兩兩因素交互作用對乙?；嗵侨〈鹊挠绊慒ig.4 Interactive effects of three factors on the DSof acetylated polysaccharides
通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗分析得到相應(yīng)的響應(yīng)面圖，可以更加直觀地反映出各單因素對二色補血草乙?；嗵侨〈鹊挠绊懡Y(jié)果以及各單因素之間交互影響的強弱關(guān)系。響應(yīng)面試驗得到的等高線圖見圖4。
由圖4可知，反應(yīng)溫度對二色補血草乙?；嗵侨〈鹊挠绊憳O為顯著，可看出其繪制的曲線最為陡峭；配料比對乙?；嗵侨〈鹊挠绊懘沃?，而影響最小的則是反應(yīng)時間，相較于反應(yīng)溫度而言，其曲線較為平滑一些。通過響應(yīng)面法預(yù)測得到的回歸模型分析[21-24]，可預(yù)測得到二色補血草多糖乙酰化的最優(yōu)合成工藝條件為反應(yīng)時間2.57 h、配料比3.26∶1、反應(yīng)溫度65.5 ℃，在預(yù)測的工藝條件下，得到的乙?；嗵堑娜〈葹?.413。
2.1.4 驗證實驗
按照上述預(yù)測的結(jié)果，從實驗操作的可操作性考慮，微調(diào)上述工藝條件為：反應(yīng)時間2.6 h、配料比3.3∶1、反應(yīng)溫度65 ℃。分別用0.1 g的二色補血草多糖，在微調(diào)后的乙?；揎椀墓に嚄l件下，做3 次多糖乙?；叫袑嶒?，得到的乙酰化二色補血草多糖乙?；〈鹊钠骄禐?.409，實驗結(jié)果表明，通過回歸方程預(yù)測得到的工藝條件與實際操作工藝條件十分吻合。
2.2 二色補血草乙?；嗵堑某醪浇Y(jié)構(gòu)分析
2.2.1 紅外光譜
分別將二色補血草多糖、二色補血草乙?；嗵呛弯寤浹心浩螅t外光譜儀進(jìn)行測定。結(jié)果如圖5所示。
圖5 二色補血草多糖（A）和二色補血草乙?；嗵牵˙）的紅外光譜圖Fig.5 IR spectra of native (A) and acetylated (B) Limonium bicolor polysaccharides
由圖5可見，經(jīng)過乙酰化后的二色補血草多糖的紅外譜圖，在1 733 cm-1出現(xiàn)了酯基的C=O伸縮振動，1 247 cm-1處有一個較弱的酯基的C—O伸縮振動，這表明存在乙酰基[25]。OH伸縮振動強度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于C—O伸縮振動，這說明乙酰化樣品的取代度并不是太高，這一點通過羥胺比色法已經(jīng)被證明。此外，從圖5還可以看出，兩圖的紅外吸收光譜非常接近，這說明乙酰化修飾并未改變二色補血草多糖的大體結(jié)構(gòu)。
2.2.2 紫外光譜
圖6 樣品的紫外吸收光譜圖Fig.6 Ultraviolet absorption spectra of native and acetylated Limonium bicolor polysaccharides
由圖6可知，乙?；昂蟮亩a血草多糖在200～480 nm波段的紫外光譜比較相似，但是根據(jù)UV2501PC 隨機軟件分析發(fā)現(xiàn)，乙酰化后的多糖在252～272 nm波長處存在一個弱的吸收峰，這可能是由于羰基產(chǎn)生的。
通過紅外和紫外譜圖分析可知，本研究已經(jīng)成功制備得到了二色補血草乙?；嗵恰?/p>
2.3 二色補血草乙?；嗵堑目寡趸钚?/p>
2.3.1 羥自由基清除率
由圖7可知，經(jīng)過乙?；揎椇蟮亩a血草多糖清除羥自由基的最大清除率為69.2%，比乙?；岸嗵堑淖畲笄宄?6.3%提高了22.9%，清除羥自由基的能力有了明顯的提高。
圖7 二色補血草乙?；嗵菍αu自由基的清除作用Fig.7 Hydroxyl radical scavenging capacity of native and acetylated Limonium bicolor polysaccharides
2.3.2 超氧陰離子自由基清除率
圖8 二色補血草乙酰化多糖對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.8 Superoxide anion radical scavenging capacity of native and acetylated Limonium bicolor polysaccharides
由圖8可知，經(jīng)過乙?；揎椇蟮亩a血草多糖清除超氧陰離子自由基的最大清除率為81.3%，比乙?；岸嗵堑淖畲笄宄?5.2%提高了24.7%，清除超氧陰離子自由基的能力也有了明顯的提高。
抗氧化性實驗結(jié)果說明，乙?；揎椂a血草多糖，可有效地提高其抗氧化活性。
3 結(jié) 論
本研究對二色補血草多糖進(jìn)行乙?；揎椀墓に嚶肪€進(jìn)行研究，并通過響應(yīng)面試驗分析方法優(yōu)化了其最優(yōu)的修飾工藝條件為反應(yīng)時間2.6 h、配料比3.3∶1、反應(yīng)溫度65 ℃，在此條件下修飾制得的二色補血草乙?；嗵堑囊阴；〈葹?.409。利用該方法對多糖進(jìn)行乙?；揎?，具有反應(yīng)可操作性強、試劑便宜易得、多糖的乙酰化取代度較高的優(yōu)點，是一種較理想的多糖乙?；揎椃椒?。通過二色補血草多糖乙?；苌锍蹶庪x子自由基和羥自由基的清除實驗表明，經(jīng)過乙酰化修飾后的抗氧化能力較之乙?；揎椙暗亩嗵怯辛朔浅Ｃ黠@的改善，其抗氧化能力進(jìn)一步增強。
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Optimization of Acetylation Process for Polysaccharides from Limonium bicolor Kunze
ZHAO Peng, SONG Xiao, ZHANG Ting-ting, TANG Zhi-shu, ZHANG Li-hua
(School of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)
In this study, response surface methodology was employed to optimize the acetylation conditions of polysaccharides from Limonium bicolor Kunze. The degree of substitution (Ds) of acetylated polysaccharides was investigated as a function of reaction time, molar ratio of acetic anhydride to polysaccharides, and reaction temperature. The optimal conditions for acetylating polysaccharides from Limonium bicolor Kunze were found to be reaction at 65 ℃ for 2.6 h with an acetic anhydride-to-polysaccharide ratio of 3.3:1. The maximum DS of 0.409 was obtained under the optimized reaction conditions. Antioxidant assays demonstrated that compared with Limonium bicolor Kunze polysaccharides, the antioxidant capacity of acetylated derivatives was significantly improved.
Limonium bicolor Kunze; polysaccharides; acetylation; response surface methodology; antioxidant capacity
TS272
A
1002-6630（2014）18-0052-05
10.7506/spkx1002-6630-201418010
2014-04-11
陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2012K19-04-07）；陜西省教育廳專項科研計劃項目（2010JK521）
趙鵬（1977—），男，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物分離純化及修飾。E-mail：zhaopeng65@sina.com
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