響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化番木瓜籽中硫代葡萄糖苷酶解工藝

李文釗，杜依登，朱華平*，史宗義，時(shí)瀛洲，阮美娟

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化番木瓜籽中硫代葡萄糖苷酶解工藝

李文釗，杜依登，朱華平*，史宗義，時(shí)瀛洲，阮美娟

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析對(duì)番木瓜籽中硫代葡萄糖苷（硫苷）的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀鑒定酶解產(chǎn)物中的異硫氰酸酯種類。結(jié)果表明：酶解緩沖液pH值、酶解時(shí)間對(duì)異硫氰酸酯得率有顯著影響，酶解溫度影響不顯著；得到的最優(yōu)酶解條件為酶解緩沖液pH 4.8、酶解時(shí)間40 min、酶解溫度27 ℃，在此條件下異硫氰酸酯得率為13.5‰；GC-MS結(jié)果表明，番木瓜籽硫苷酶酶解產(chǎn)物中只含有異硫氰酸芐酯一種異硫氰酸酯。

番木瓜籽；硫代葡萄糖苷；酶解；異硫氰酸酯

番木瓜籽是番木瓜加工過(guò)程中的廢棄物，一直以來(lái)沒(méi)有得到合理的開(kāi)發(fā)利用[1-2]，研究發(fā)現(xiàn)，番木瓜籽中含有一定量的硫代葡萄糖苷[3]（簡(jiǎn)稱硫苷），硫苷是一種常見(jiàn)于十字花科的次生代謝產(chǎn)物，目前未見(jiàn)報(bào)道其有直接的生理功能[4]，但當(dāng)植物受到損傷時(shí)，硫苷與內(nèi)源硫苷酶接觸，在不同的條件下降解成一系列的具有生物活性的代 謝產(chǎn)物[5-6]，其中以異硫氰酸酯類最受關(guān)注。異硫氰酸酯類物質(zhì)能賦予食物特殊的風(fēng)味[7]，同時(shí)，研究表明異硫氰酸酯類物質(zhì)具有較強(qiáng)的防腐抗菌[8-9]和降低某些癌癥發(fā)生[10]的作用。目前，已查到相關(guān)番木瓜成熟過(guò)程中籽中硫苷和異硫氰酸酯類含量的分析報(bào)道[11-12]，但暫未見(jiàn)有關(guān)硫苷轉(zhuǎn)化為異硫氰酸酯類條件優(yōu)化的研究報(bào)告。本研究?jī)?yōu)化異硫氰酸酯類生成條件，選擇性的引導(dǎo)番木瓜籽中硫苷降解生成異硫氰酸酯類，為研究異硫氰酸酯類的生物功能活性提供原料來(lái)源，為番木瓜籽的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番木瓜籽 海南思坦德生物科技有限公司；無(wú)水乙醇（分析純） 天津市化學(xué)試劑三廠；氨水、二氯甲烷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、抗壞血酸（均為分析純） 天津市化學(xué)試劑一廠；正己烷、無(wú)水硫酸鈉（均為分析純） 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；異硫

氰酸芐酯（純度98%） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；752E紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 天津市普瑞斯儀器有限公司；AB204-N電子分析天平、DL22 F&D全自動(dòng)電位滴定儀 梅特勒-托利多儀器有限公司；HS-4磁力攪拌器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；HHS11-2B電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械五廠；XW-80A漩渦混合器江蘇海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵 河南省予華儀器有限公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；4000MS氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)瓦里安技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硫苷酶解條件的單因素試驗(yàn)

分別以原料粒徑、料液比、酶解緩沖液pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間為自變量，以異硫氰酸酯得率為考察指標(biāo)，研究各因素對(duì)異硫氰酸酯得率的影響。原料粒徑選取90～120、120～150、150～180、180～250、250～380 μm五個(gè)水平；料液比選取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）五個(gè)水平；酶解液pH值選取1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5七個(gè)水平；酶解溫度選取10、20、30、40、50 ℃五個(gè)水平；酶解時(shí)間選取0、20、40、60、80 min五個(gè)水平。

1.3.2 硫苷酶解條件的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響內(nèi)源硫苷酶活性的主要因素，以異硫氰酸酯得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解條件。

1.3.3 異硫氰酸酯含量的測(cè)定

在NY/T 1596—2008《油菜餅粕中異硫氰酸酯的測(cè)定：硫脲比色法》[13]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，利用內(nèi)源酶進(jìn)行酶解代替在樣品前處理中加芥子酶。

1.3.4 異硫氰酸酯提取物制備

木瓜籽粉碎、過(guò)篩，按照優(yōu)化的條件酶解，加二氯甲烷混合均勻，在室溫條件下振蕩0.5 h，4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取下層二氯甲烷相至圓底燒瓶中，接旋蒸儀蒸發(fā)去除二氯甲烷，收集殘留物，加過(guò)量的無(wú)水硫酸鈉，冷藏待GC-MS分析[14-15]。

1.3.5 異硫氰酸酯提取物的GC-MS分析

色譜條件[16]：D B-5石英毛細(xì)管柱（3 0 m× 0.32 mm，0.25 μm）；升溫程序：50 ℃保持2 min，以10 ℃/min速率升至250 ℃，保持5 min；載氣為He，流速1.4 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度200 ℃；離子源溫度200 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～600。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)中每個(gè)因素的各個(gè)水平和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的每個(gè)試驗(yàn)組合都重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果采用3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值表示，數(shù)據(jù)使用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Matlab進(jìn)行方差分析及多重比較，使用OriginPro 9.0繪制圖表，響應(yīng)面設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析使用Design-Expert 8.05b。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 原料粒徑對(duì)異硫氰酸酯得率的影響

經(jīng)方差分析得不同原料粒徑對(duì)異硫氰酸酯得率的影響極顯著（P＜0.01）；從圖1可以看出，隨著原料粒徑的增大，異硫氰酸酯得率逐漸減??；從原理上講，粒徑越小，酶和底物的接觸越充分，得率越高，但是由于粒徑越小，所需要的粉碎時(shí)間越長(zhǎng)，不僅耗費(fèi)了大量能源，也會(huì)產(chǎn)生大量熱量，由于異硫氰酸酯易揮發(fā)，受熱后會(huì)有一定的損失，因此，綜合考慮本實(shí)驗(yàn)選擇原料粒徑為小于150 μm。

圖1 原料粒徑對(duì)異硫氰酸酯得率的影響Fig.1 Effect of material particle size on the yield of isothiocyanates

2.1.2 料液比對(duì)異硫氰酸酯得率的影響

經(jīng)方差分析得不同料液比對(duì)異硫氰酸酯得率的影響顯著（P＜0.05），經(jīng)多重比較得料液比（g/mL）為1∶5和1∶20時(shí)得率有顯著差異；從圖2可以看出，在料液比為1∶20時(shí)異硫氰酸酯得率最高。

圖2 料液比對(duì)異硫氰酸酯得率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of isothiocyanates

2.1.3 酶解緩沖液pH值對(duì)異硫氰酸酯得率的影響

經(jīng)方差分析得不同酶解緩沖液pH值對(duì)異硫氰酸酯得率影響極顯著（P＜0.01）；由圖3可見(jiàn)，在pH值小于3.5時(shí)，得率隨著pH值升高而增大；在pH值大于3.5時(shí)，得率隨著pH值升高而減??；在pH值在3.5～4.0時(shí)，異硫氰酸酯得率最高。據(jù)文獻(xiàn)[17-18]報(bào)道在pH值不同時(shí)，硫苷的降解產(chǎn)物也不相同，其主要的降解產(chǎn)物有異硫氰酸酯、腈類、硫氰酸酯、惡唑烷酮等，本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在pH值在3.5～4.0時(shí)，番木瓜籽中的硫苷更偏向于轉(zhuǎn)化為異硫氰酸酯。

圖3 酶解緩沖液pH值對(duì)異硫氰酸酯得率的影響Fig.3 Effect of buffer pH on the yield of isothiocyanate

2.1.4 酶解溫度對(duì)異硫氰酸酯得率的影響

經(jīng)方差分析得不同酶解溫度對(duì)異硫氰酸酯得率影響極顯著（P＜0.01）；從圖4可知，番木瓜籽中硫苷酶在20～30 ℃時(shí)活性較高。現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)的不同來(lái)源硫苷酶的最適溫度在25～80 ℃均有報(bào)道[19-20]，說(shuō)明硫苷酶對(duì)溫度比較敏感，針對(duì)不同來(lái)源的硫苷酶要針對(duì)性的研究。

圖4 酶解溫度對(duì)異硫氰酸酯得率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the yield of isothiocyanate

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)異硫氰酸酯得率的影響

圖5 酶解時(shí)間對(duì)異硫氰酸酯得率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on the yield of isothiocyanate

經(jīng)方差分析得不同酶解時(shí)間對(duì)異硫氰酸酯得率影響極顯著（P＜0.01）；由圖5可以看出，在酶解開(kāi)始20 min內(nèi)，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，異硫氰酸酯得率迅速增加，說(shuō)明酶解反應(yīng)初期反應(yīng)迅速；當(dāng)酶解時(shí)間為20～40 min時(shí)，異硫氰酸酯得率達(dá)最高點(diǎn)；由于異硫氰酸酯易揮發(fā)，隨酶解進(jìn)程到40 min以后，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，異硫氰酸酯得率不但沒(méi)有增加反而呈下降趨勢(shì)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken模型的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)酶解緩沖液pH值（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）3 個(gè)主要因素做響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 1 Box-Behnken design scheme and corresponding results

2.2.2 模型方差分析

對(duì)表中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析可得到二階擬合模型：得率/‰=-20.500 89+13.110 83A+ 0.269 94B-0.040 75C-0.017 50AB+0.040 00AC-0.001 25BC-1.496 67A2-0.002 54B2-0.001 42C2。響應(yīng)面二階回歸模型方差分析見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)二階回歸模型方差分析表Table 2 Analysis of variance for the second-order regression model

表2顯示，該回歸模型P＜0.000 1，方程模型極顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05，失擬不顯著，可以利用該模型預(yù)測(cè)異硫氰酸酯的最高得率；結(jié)果顯示，酶解緩沖液pH值對(duì)異硫氰酸酯得率影響極顯著，酶解時(shí)間對(duì)得率影響顯著，酶解溫度對(duì)得率影響不顯著；pH值和溫度、pH值和時(shí)間的交互相應(yīng)對(duì)得率有顯著影響，說(shuō)明，試驗(yàn)因素對(duì)得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，交互項(xiàng)、二次項(xiàng)也有顯著影響。

根據(jù)方差分析結(jié)果，pH值-時(shí)間、pH值-溫度之間具有一定的交互效應(yīng)，因此通過(guò)單因素試驗(yàn)不能確定最優(yōu)酶解條件，需要考慮3 個(gè)因素之間的交互作用。通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行優(yōu)化，以異硫氰酸酯得率最高為優(yōu)化目標(biāo)，得到在pH值為4.8、酶解時(shí)間為40 min、酶解溫度27 ℃時(shí)異硫氰酸酯得率最高，為13.5‰。

2.3 異硫氰酸酯提取物的GC-MS分析

圖6 異硫氰酸酯提取物的GC-MS分析譜圖Fig.6 GC-MS profile of isothiocyanates extracted from the hydrolysate

提取物的GC-MS結(jié)果見(jiàn)圖6，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)初步判定出一種異硫氰酸酯類物質(zhì)，即異硫氰酸芐酯（保留時(shí)間14.10 min），這與文獻(xiàn)[21-25]報(bào)道稱木瓜籽硫苷酶酶解產(chǎn)物中只含異硫氰酸芐酯這一種異硫氰酸酯的結(jié)果一致。同時(shí)，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，提取物中含有異氰酸芐酯（保留時(shí)間8.6 min）、芐基腈（保留時(shí)間9.00 min）和硫氰酸芐酯（保留時(shí)間13.68 min）3 種可能的酶解產(chǎn)物，這說(shuō)明硫苷并沒(méi)有完全按照異硫氰酸酯途徑酶解，酶解過(guò)程中還可能產(chǎn)生了少量以上幾種產(chǎn)物，因此，還有必要對(duì)硫苷酶解途徑進(jìn)行研究，探討通過(guò)不同酶解條件來(lái)控制酶解產(chǎn)物的可能性。

3 結(jié) 論

本研究以異硫氰酸酯得率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)，考察了原料粒徑、料液比、酶解溫度、時(shí)間及pH值等因素對(duì)番木瓜籽中硫苷酶解反應(yīng)的影響；并經(jīng)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，獲得了硫苷酶的最優(yōu)酶解條件為酶解緩沖液pH 4.8、酶解時(shí)間40 min、酶解溫度27 ℃，在此條件下異硫氰酸酯得率為13.5‰。GC-MS結(jié)果表明，番木瓜籽硫苷酶酶解產(chǎn)物中只含有異硫氰酸芐酯一種異硫氰酸酯，但是酶解產(chǎn)物中同時(shí)還鑒定出芐基腈、硫氰酸芐酯和異氰酸芐酯，說(shuō)明即使在最優(yōu)反應(yīng)條件下，硫苷并非完全按照異硫氰酸芐酯途徑轉(zhuǎn)化，有必要通過(guò)進(jìn)一步研究考察硫苷在不同酶解條件下酶解途徑。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions of Glucosinolates from Carica papaya Seeds by Response Surface Methodology

LI Wen-zhao, DU Yi-deng, ZHU Hua-ping*, SHI Zong-yi, CHI Ying-zhou, RUAN Mei-juan
(College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

The enzymatic hydrolysis of glucosinolates (GS) from Carica papaya seeds was optimized by response surface methodology with Box-Behnken design (BBD). The resulting isothiocyanates were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that enzyme buffer solution pH and hydrolysis time had significant effects on the yield of isothiocyanates, whereas enzymatic hydrolysis temperature had no significant effect. The optimal hydrolysis conditions were found to be hydrolysis at 27 ℃ for 40 min in a buffer solution at pH 4.8. Under the optimized conditions, the yield of isothiocyanates was 13.5‰. GC-MS analysis showed that only one isothiocyanate—benzyl isothiocyanate was detected in the hydrolysate.

Carica papaya seed; glucosinolates; enzymatic hydrolysis; isothiocyanates

TS209

A

1002-6630（2014）18-0028-04

10.7506/spkx1002-6630-201418006

2013-12-17

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD33B09；2012BAD31B06）

李文釗（1970—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸づc保鮮。E-mail：liwenzhao5518@sina.com

*通信作者：朱華平（1980—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：zhuhuaping@126.com