鯉幼魚飼料中DHA的適宜添加量研究

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

微藻（Microalgae）含有天然生物活性物質(zhì)，豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)以及抗氧化物質(zhì)，同時還含有免疫刺激物的特殊成分（Amar等，2004），尤其是富含n-3PUFA，是海洋魚類等生長、發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)（Brown等，1997）。近年來，微藻應(yīng)用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖已經(jīng)有大量研究，取得了不少成就，但主要集中海洋甲殼類、軟體動物以及魚類。Tan等（2009）利用藻蛋白來替代魚粉研究Apostichopus japonicus，提高了其生長速度和存活率；Kanazawa等（1977）對牙鲆幼體DHA需求量研究，飼料中適宜添加量為1%。同樣，Nandeesha等（2001）對印度鯉飼喂不同水平的螺旋藻能明顯改善生長性能。然而富含DHA的藻粉在鯉上的應(yīng)用研究鮮有報道。本試驗擬通過在飼料中添加富含DHA微藻粉對鯉幼魚生長性能及血液生化指標(biāo)等影響的研究，探討鯉幼魚飼料中適宜的DHA添加比例，為DHA在該魚種養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

DHA藻粉（商品名）由江西泰成生物科技有限公司（南昌）提供，其蛋白質(zhì)29.2%、粗脂肪51.1%、碳水化合物10.19%、灰分4.34%，DHA 35.5%、DPA 8.13%。試驗飼料依據(jù)鯉魚飼料營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（SC/T 1026—1998）配制蛋白水平為36.14%、脂肪水平為13.12%的基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%的DHA藻粉，用纖維素調(diào)節(jié)的近似等氮、等能的5種試驗飼料（見表1），分別用D1（基礎(chǔ)對照組）、D2、D3、D4、D5表示，將試驗飼料中各原料充分拌勻后，用SZLH-2制粒機（洛陽）加工成直徑為1.50 mm的顆粒飼料，于40℃烘干12 h，-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗魚與飼養(yǎng)管理

鯉幼魚購于河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院種魚繁殖場。選擇體格健壯、平均體重（11.31±0.24）g的鯉幼魚750尾，隨機分為5組（Ⅰ~Ⅴ組），每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)50尾，分養(yǎng)于15個規(guī)格為1.5×1.2×1.0 m3的塑料桶中，進行為期14 d馴化，馴化期內(nèi)投喂基礎(chǔ)飼料2次（08:30、17:30，按體重的3.5%~4.0%進行投喂）。試驗用水為經(jīng)曝氣24 h的自來水，pH值為7.2~7.4，溶氧為6.1~6.6 mg/l，水溫由加熱棒控溫為25~26.5℃；試驗期間每日換水1/3，同時收集殘餌及糞便。

1.3 試驗設(shè)計

馴化結(jié)束后，Ⅰ~Ⅴ組分別飼喂含微藻粉試驗飼料（D1、D2、D3、D4、D5），試驗期共60 d。每次投喂結(jié)束后，升起食臺，收集殘餌，烘干并稱重。試驗結(jié)束時停食1 d。試驗開始前和結(jié)束后分別對Ⅰ~Ⅴ組魚進行常規(guī)生長性能測定。

1.4 測定指標(biāo)及計算方法

特定生長率（SGR,%/d）=（LnWt-LnW0）×100/t；

蛋白質(zhì)效率（PER,%）=（Wt-W0）×100（/F×P）；

餌料系數(shù)（FCR）=F（/Wt-W0）。

式中：W0——試驗開始時魚體重（g）；

Wt——試驗結(jié)束時魚體重（g）；

F——餌料攝入量（g）；

t——養(yǎng)殖試驗天數(shù)（d）；

P——飼料中蛋白質(zhì)含量（g）。

1.5 血清的制備及指標(biāo)測定

生長試驗結(jié)束后，分別在各試驗組中隨機抽取6尾試驗魚，心臟抽血，肝素鈉抗凝。在室溫下放置1 h。并置于冰箱中（4℃）過夜，3 500 r/min離心15 min制得血清，用于測定試驗血清生化指標(biāo)。

血清總蛋白、白蛋白、球蛋白含量由全自動生化分析儀（貝克曼ProCX4，德國）測定；谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZS）、過氧化氫酶（CAT）活性測定由南京建成生物工程有限公司生產(chǎn)的試劑盒，測定方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作；血糖、總膽固醇、總甘油三酯含量采用全自動分析儀（島津IL-AB6OO，日本）測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理和分析

試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Tukey多重比較，差異顯著水平為P<0.05。為了預(yù)測最佳水平的添加量，采用Zeitoun等（1976）所描述的二次多項式回歸分析（Y=aX+bX+c）確定。

2 結(jié)果

2.1 鯉幼魚生長性能（見表2）

表2 DHA對鯉幼魚生長性能的影響

隨添加量增加，SGR、PER先升后降，Ⅲ組最高，顯著高于其他組（P<0.05），Ⅲ組SGR比Ⅰ組（對照）、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ組分別提高21.88%、9.2%、5.8%和30.62%，PERⅢ組比Ⅰ組（對照）、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ組分別提高11.49%、6.59%、8.38%和23.57%；SGR、PER在Ⅱ、Ⅳ組之間差異不顯著（P>0.05）。Ⅲ組FCR（1.43）顯著低于其他組（P<0.05），比Ⅰ組（對照）、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ組分別降低10.63%、5.92%、7.74%和14.37%；但Ⅱ與Ⅳ組、Ⅰ與Ⅴ組差異不顯著（P>0.05）。SGR與DHA藻粉添加量之間回歸分析表明，Y=-0.012X2+0.043 7X+2.295 8（R2=0.897 5），最佳添加量為1.82%（含DHA 0.65%）。

2.2 鯉幼魚血清生化指標(biāo)（見表3）

從表3可知，不同DHA藻粉添加水平對鯉幼魚血清的生化指標(biāo)產(chǎn)生不同的影響。血清總蛋白、白蛋白、球蛋白含量隨添加劑量增加逐漸增加，其中試驗Ⅳ、Ⅴ組顯著高于Ⅰ組和Ⅱ組（P<0.05），但Ⅳ、Ⅴ組間無顯著差異（P>0.05）；膽固醇隨添加劑量增加先增后降，Ⅴ組顯著降于其它各組（P<0.05），分別比Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ降低10.48%、20%、23.3%、15.95%；甘油三酯與膽固醇的情況相似；Ⅱ~Ⅳ組血糖水平差異不顯著（P>0.05），但是顯著高于Ⅰ組（對照組）（P<0.05），分別比Ⅰ組高0.57%、4.87%、4.30%， 但Ⅴ組血糖則又顯著低于對照組（P<0.05），降低10.89%；GOT、GPT活性隨添加劑量增加而增加，但添加水平2%（DHA含量為0.71%）以下與對照組無顯著差異（P>0.05），添加2.0%（DHA含量為0.71%）或以上則顯著增加（P<0.05），Ⅴ組比對照組提高35.89%、39.53%；LZS與相照組對比則隨添加劑量增加顯著增加（P<0.05），分別增加38.94%、113.11%、144.28%、148.13%，但Ⅳ、Ⅴ組差異不顯著（P>0.05）；SOD、CAT在DHA含量小于0.71%添加水平時與對照組無顯著差異（P>0.05），大于或等于0.71%則顯著增加（P<0.05），Ⅳ、Ⅴ組SOD活性分別比對照組提高5.79%、7.90%，CAT活性提高42.90%、80.03%。

表3 DHA對鯉幼魚血清生化指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 DHA對鯉幼魚生產(chǎn)性能的影響

淡水雜食性魚類如鯉魚具有從飼料中將C18∶3n-3的脂肪酸合成自身需要的C20∶5n-3、C22∶6n-3脂肪酸（Bellm等，1986）；而對于海洋食肉魚類則直接從食物中獲?。˙uzzi等，1997）。然而外源DHA添加在淡水魚飼料中研究鮮有報道。王桂芹等（2010）在鯉魚飼料中添加0.5%~1.5%的DHA，能顯著促進生長性能；潘瑜等（2012）在鯉魚飼料中添加不同脂肪源，結(jié)果顯示，富含不飽和脂肪酸（DHA）的魚油組生長性能最好；同樣，Steffens等（2007）研究鯉魚飼料添加較低水平的DHA有顯著促生長效應(yīng)；吉紅等（2011）對草魚研究也得到相似結(jié)果。Ren等（2012）研究鯉魚飼料中添加6.24%的DHA對生長影響差異并不顯著。Ahmed Al-Souti等（2012）在對羅非魚（Oreochromis sp）飼料添加不同水平魚肝油（含DHA）研究生長性能也顯示差異不顯著。本試驗中，添加1.0%~2.0%DHA藻粉顯著提高鯉幼魚的生長。淡水魚類對于飼料DHA水平對生長差異的影響可能與物種、生長階段、飼料脂類的形式和養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)；而Buchtová等（2010）認為，這種對DHA需求差異可能由于鯉魚種脂肪酸合成酶基因不同造成，同樣Ahmed等（2012）也證實上述觀點。

3.2 DHA鯉幼魚血清生化指標(biāo)的影響

魚類血清生化指標(biāo)變化能快速反映其機體所處的機能狀態(tài)（吉紅等，2010）。血清蛋白水平可以用來衡量蛋白質(zhì)、氨基酸的合成、代謝、吸收、轉(zhuǎn)運等；本研究中DHA含量在0.35以下（藻粉的添加0.5%~1.0%），鯉魚的血清蛋白水平與對照組無顯著差異，但略有升高，說明飼料組成可滿足鯉幼魚對蛋白質(zhì)的需求，同時有增強蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運功能的效果，可能與飼料添加DHA藻粉尤其DHA有關(guān)。投喂10%的富含DHA的魚油或藻粉對于促進魚類生長、增強免疫在先前研究也得到證明（Subhadra等，2006）。Visentainer等（2005）證實，羅非魚飼料添加富含DHA魚油（DHA含量9.9 g/kg）增強血清蛋白水平，并提高肌肉不飽和脂肪酸水平。陳家林等（2011）對異育銀鯽飼料添加不同脂肪源（DHA含量不同），結(jié)果表明，該魚能很好地利用低水平DHA，提高血清蛋白水平，尤其球蛋白。投喂DHA增強魚的血清蛋白水平主要是增強了免疫反應(yīng)能力（Wiegertjes等，1996）。本試驗中，LZS、SOD、CAT水平隨DHA藻粉添加量增加其活性持續(xù)增大，說明免疫增強，尤其LZS增強迅速。SOD增加顯著，顯示DHA藻粉誘導(dǎo)機體氧化應(yīng)激增強，進而影響細胞膜完整性，DHA添加水平過高將損傷鯉免疫系統(tǒng)，與Ji等（2011）對草魚研究結(jié)果相似；同樣，于得慶等（2005）對經(jīng)耐力訓(xùn)練的小鼠也證實DHA對SOD有明顯的促進作用；吉紅等（2009）利用DHA研究鯉魚抗氧化活性認為：SOD、CAT增強，可能是機體為了減輕自由基的損傷而產(chǎn)生的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)。本試驗結(jié)果表明，低劑量的DHA（小于0.35%）添加到飼料中，除LZS外，SOD、CAT活性均與對照組相比差異不顯著，表明了60 d的飼喂，鯉魚對含DHA藻粉飼料產(chǎn)生了適應(yīng)性調(diào)節(jié)；由于魚類的特異性免疫系統(tǒng)還不完善，LZS作為魚類非特異性免疫因子在抵抗感染、應(yīng)激等中起著重要作用。楊鶯劫等（2008）在黃鱔基礎(chǔ)飼料中添加DHA，試驗結(jié)果表明，試驗組血清LSZ活性較對照組顯著增大；周小秋等（2005）對建鯉魚飼料不飽和脂肪酸研究也表明，改變n-3和n-6比例顯著改變LZS。甘油三酯與膽固醇密切相關(guān)，膽固醇的升降影響甘油三酯的升降（何志謙，2000）。Hegested等（1965）也認為，血清膽固醇的變化與PUFA攝取量呈負相關(guān)。本研究中血清膽固醇和甘油三酯升降呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，說明飼料中低劑量添加DHA藻粉有利于脂質(zhì)運輸，表現(xiàn)出血清蛋白運輸系統(tǒng)對飼料的應(yīng)答效應(yīng)（Ding等，2010），而高劑量添加n-3系列脂肪酸將阻礙甘油三酯滲入到肝的極低密度脂蛋白顆粒中（聞芝梅，1998），導(dǎo)致肝細胞分泌到血循環(huán)中的甘油三酯減少，從而降低血清中甘油三酯的含量（於葉兵等，2012）。通常狀態(tài)下，GOT、GPT主要分布于肝組織中，血清含量多少與肝組織細胞是否受到應(yīng)激或損傷有關(guān)（Nyb?lom等，2004）。本試驗中，高劑量DHA含量（1.42%）組GOT、GPT明顯高于其他組，說明Ⅳ、Ⅴ組引起魚體一定程度上的應(yīng)激反應(yīng)或損傷，但血糖水平在DHA含量添加水平0.71%以下時差異不顯著，說明肝功能相對穩(wěn)定，而添加1.42%則血糖降低、轉(zhuǎn)氨酶升高表明，肝細胞功能受到不同程度損傷。