液體培養(yǎng)發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌代謝物提取方法的比較分析

韓培培，孫 瑩，段文倩，石 拓，賈士儒

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

液體培養(yǎng)發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌代謝物提取方法的比較分析

韓培培，孫 瑩，段文倩，石 拓，賈士儒

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

比較了基于氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌代謝物的2種不同提取方法．在對(duì)樣品進(jìn)行快速洗滌和淬滅后，分別采用冷甲醇法和甲醇/氯仿法對(duì)樣品進(jìn)行提取，并考察了樣品量對(duì)提取效果的影響．結(jié)果顯示，從提取到的代謝物種類和豐度角度，冷甲醇法的提取效果要優(yōu)于甲醇/氯仿法，且采用50mg樣品量的提取效果較佳．通過本方法，在發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌中共檢測(cè)到46種代謝物，包括19種有機(jī)酸、1種無機(jī)酸、13種氨基酸、4種胺類、4種醇類和5種糖類物質(zhì)．

發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌；藍(lán)細(xì)菌；氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；代謝物；提取方法

發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌，又叫發(fā)狀念珠藻(Nostoc flagelliforme)，俗稱發(fā)菜，是一種陸生藍(lán)細(xì)菌，主要分布在荒漠和半荒漠地區(qū)，是荒漠中的主要固氮及光合藻類[1–3]．除耐旱特性外，發(fā)菜還具有耐堿、抗紫外線、耐高溫等能力，研究其抗逆性能有助于了解生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制[4]．代謝物是細(xì)胞對(duì)遺傳因子或環(huán)境因子作出生理響應(yīng)后的最后產(chǎn)物，對(duì)代謝物進(jìn)行研究可以幫助人們反向解析被研究對(duì)象的生理生化狀態(tài)與預(yù)設(shè)環(huán)境變化之間的關(guān)系，從而促進(jìn)對(duì)其中相應(yīng)機(jī)理和本質(zhì)的理解[5]．本研究通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌的代謝物進(jìn)行系統(tǒng)研究，建立系統(tǒng)分析代謝物的方法，為進(jìn)一步從代謝水平上研究發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌的抗逆機(jī)制奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc flagelliforme)由天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存．

甲醇(色譜純)、氯仿(色譜純)，天津化學(xué)試劑一廠；吡啶(色譜純)，Sigma公司；N–甲基三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)，F(xiàn)luka公司；氘標(biāo)記琥珀酸，ISOTEC公司．

1.2 方法

1.2.1 發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)

采用BG11培養(yǎng)基[6]，500mL三角瓶裝液量200mL，培養(yǎng)溫度(25±0.2)℃，光照度1,000,lx條件下靜止培養(yǎng)15,d．

1.2.2 代謝物的提取方法

甲醇/氯仿法：參考文獻(xiàn)[7]的方法并進(jìn)行了優(yōu)化.

細(xì)胞抽濾收集后用液氮研磨成粉末，稱取適量細(xì)胞粉末，加入–20℃預(yù)冷的溶液(V甲醇∶V氯仿∶V水＝2.5∶1∶1)1mL，充分混勻，室溫下振蕩30min. 14,000r/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)入新的EP管中，4℃保存；向殘?jiān)性偌尤毹C20℃預(yù)冷的代謝提取液(V甲醇∶V氯仿＝1∶1)500μL，充分混勻，室溫下振蕩30min．14,000r/min離心10min，將兩次所得的上清液合并，加入250μL水，充分混勻后，6,400r/min離心20min分層，取150μL上清液，–60℃凍干．其中細(xì)胞粉末分別稱取30mg和50mg，標(biāo)記為1-30和1-50．

冷甲醇法：參考文獻(xiàn)[8]的方法并進(jìn)行了優(yōu)化．細(xì)胞抽濾收集后用液氮研磨成粉末，稱取適量細(xì)胞粉末，加入–20℃預(yù)冷的50%甲醇溶液1mL，液氮反復(fù)凍融5次，取150μL上清液，–60℃凍干．其中細(xì)胞粉末分別稱取30mg和50mg，標(biāo)記為2-30和2-50．

1.2.3 代謝物衍生化

采取兩步衍生化法，先加入50μL甲氧基銨鹽酸鹽的吡啶溶液(20mg/mL)，30℃孵育90min，肟化以保護(hù)羰基；再加入MSTFA 80μL，37℃孵育30min，轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中室溫靜置2h后進(jìn)行分析．

1.2.4 代謝物的檢測(cè)

采用GC-TOF-MS(Waters GC-TOF-MS系統(tǒng)，包括配有安捷倫7683自動(dòng)進(jìn)樣器、安捷倫6890氣相色譜和TOF飛行時(shí)間質(zhì)譜儀)對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析．色譜條件：色譜柱為DB–5氣相色譜柱(30m× 0.25mm，0.25μm)，進(jìn)樣量1μL，分流比1∶1，進(jìn)樣口溫度280℃，接口溫度270℃．氦氣流量：恒壓模式，91kPa．升溫程序：70℃保持2min，以5℃/min的速率升到290℃，并在290℃保持6min．質(zhì)譜參數(shù)：放射電流100μA，游離電壓70eV，源溫250℃，掃描范圍(m/z)50～800，掃描速度為每秒2譜圖．

1.2.5 色譜峰的識(shí)別及定量

色譜峰的識(shí)別是通過與NIST library比較完成．采用每種物質(zhì)的特征離子的單位質(zhì)量色譜圖的峰面積進(jìn)行定量．

2 結(jié)果與分析

通過前期對(duì)GC-MS檢測(cè)條件的優(yōu)化，建立了基于GC-MS的代謝物檢測(cè)方法．圖1為由GC-MS分析得到的發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌胞內(nèi)代謝物的總離子流圖．由圖1可知，通過提取方法1-30、1-50、2-30和2-50得到的代謝物對(duì)應(yīng)的總離子流圖可以明顯看出方法2-30和2-50對(duì)應(yīng)總離子流圖的峰更多，即提取到的代謝物種類更多．通過進(jìn)一步分析，由GCMS檢測(cè)到發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌胞內(nèi)代謝物可分為以下幾類：有機(jī)酸、無機(jī)酸、氨基酸、胺類、醇類和糖類．

圖1 不同提取方法獲得的發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌胞內(nèi)代謝物總離子流圖Fig. 1 GC-MS chromatograms of irons of intracellular metabolites from Nostoc flagelliforme with different extracting methods

不同提取方法得到的有機(jī)酸和無機(jī)酸的種類及含量如圖2所示．從圖2中可以看出：發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌中有機(jī)酸種類較多，共檢測(cè)到19種有機(jī)酸，且不同有機(jī)酸含量差別較大．可以看出冷甲醇法提取到的有機(jī)酸種類比甲醇/氯仿法多，冷甲醇法提取到19種有機(jī)酸，而甲醇/氯仿法提取到15種有機(jī)酸，其中9，12–十八碳二烯酸、9，12，15–十八碳三烯酸、9–十六碳烯酸甲酯和軟脂酸未檢測(cè)到；且對(duì)于大多數(shù)有機(jī)酸，由冷甲醇法提取得到的含量都明顯高出甲醇/氯仿法，而2-50又明顯優(yōu)于2-30．

不同提取方法得到的氨基酸種類及含量如圖3所示．由圖3可知：在發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌中檢測(cè)到了13種氨基酸，且谷氨酸含量較高．除賴氨酸外，冷甲醇法的提取效果明顯優(yōu)于甲醇/氯仿法；除L–蘇氨酸、谷氨酸、L–鳥氨酸外，提取方法2-30與2-50差別并不明顯．

圖2 不同提取方法得到的有機(jī)酸和無機(jī)酸的種類及含量Fig. 2 Comparison of types and contents of organic and inorganic acids with different extracting methods

圖3 不同提取方法得到的氨基酸種類及含量Fig. 3 Comparison of types and contents of amino acids with different extracting methods

不同提取方法得到的胺類物質(zhì)種類及含量如圖4所示．由圖4可知：在發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌中，檢測(cè)到了4種胺類物質(zhì)，分別為羥胺、尿素、乙胺和1，4–丁二胺；其中羥胺和尿素含量相對(duì)較少．對(duì)于乙胺和1，4–丁二胺，冷甲醇法尤其是采取50mg樣品時(shí)提取效果更好，而尿素更適合采用甲醇/氯仿法進(jìn)行提?。畬?duì)于羥胺，這兩種提取方法差別不大．

圖4 不同提取方法得到的胺類物質(zhì)種類及含量Fig. 4Comparison of types and contents of amines with different extracting methods

不同提取方法得到的醇類種類及含量如圖5所示．不同提取方法得到的糖類物質(zhì)種類及含量如圖6所示．

圖5 不同提取方法得到的醇類種類及含量Fig. 5Comparison of types and contents of alcohols with different extracting methods

圖6 不同提取方法得到的糖類物質(zhì)種類及含量Fig. 6Comparison of types and contents of sugars with different extracting methods

甲醇/氯仿法未提取到丙三醇；冷甲醇法對(duì)肌醇和myo–肌醇的提取效果要好于甲醇/氯仿法；對(duì)于丙二醇，甲醇/氯仿法和冷甲醇法未呈現(xiàn)明顯差別．

由圖6可知：在發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌中共檢測(cè)到5種糖類物質(zhì)，對(duì)于吡喃半乳糖、半乳糖、D–果糖，冷甲醇法要優(yōu)于甲醇/氯仿法；對(duì)于葡萄糖，方法1-50提取效果較好．發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌中糖類代謝物種類較少，這可能與采用的自養(yǎng)方式有關(guān)．

3 討 論

在代謝物的提取過程中，為了迅速終止細(xì)胞代謝反應(yīng)，取樣后會(huì)立即進(jìn)行淬滅處理[9]．本實(shí)驗(yàn)采用的是液氮冷凍淬滅法．代謝產(chǎn)物一般用水或有機(jī)溶劑分別提取，獲得水提取物和有機(jī)溶劑提取物，從而把非極性物質(zhì)和極性物質(zhì)分開以便進(jìn)行分析．因?yàn)橐恍┨囟ㄌ崛l件往往僅適合某些類化合物，所以目前尚沒有一種能夠適合所有代謝產(chǎn)物的提取方法．應(yīng)該根據(jù)不同的化合物選擇不同的提取方法，并對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化．Maharjan等[10]研究了6種提取方法冷甲醇、熱甲醇、熱乙醇、酸、堿和甲醇/氯仿對(duì)大腸桿菌代謝物譜的影響，結(jié)果表明冷甲醇法可得到更多的代謝物．Dettmer等[11]研究了甲醇、甲醇/水、乙腈、乙腈/水、甲醇/氯仿、甲醇/異丙醇、酸性甲醇7種提取方法對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株代謝物譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇/水提取的代謝物最多．本文選擇了冷甲醇和甲醇/氯仿兩種提取方法以及兩種細(xì)胞量進(jìn)行比較，希望找出一種最優(yōu)的提取方法．結(jié)果表明，發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌中主要物質(zhì)為有機(jī)酸、氨基酸、胺類、醇類和糖類，對(duì)于大多數(shù)代謝物，冷甲醇法的提取效果都明顯優(yōu)于甲醇/氯仿法，而比較2-30和2-50，雖然提取代謝物種類上沒有變化，但在離子圖上可看出二者信噪比有顯著差異．其中信噪比(S/N)以3倍S/N為檢出限，10倍S/N為測(cè)定下限，使用30mg樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，有些物質(zhì)含量較少，低于測(cè)定下限，雖然可檢測(cè)出，但定量時(shí)會(huì)不準(zhǔn)，而50mg的樣品量就可以滿足要求，因而方法2-50優(yōu)于2-30，即對(duì)于發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌，冷甲醇法的提取效率要優(yōu)于甲醇/氯仿法．并且采用50mg樣品量的效果較好．

4 結(jié) 論

采用50mg樣品量的冷甲醇法適用于發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌代謝產(chǎn)物的提取和進(jìn)一步的GC-MS分析．通過本文建立的代謝物分析方法，在發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌中共檢測(cè)、鑒定到了46種代謝物，其中包括19種有機(jī)酸、1種無機(jī)酸、13種氨基酸、4種胺類、4種醇類和5種糖類物質(zhì)．本文工作為進(jìn)一步從代謝水平上研究發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌的生理機(jī)制奠定了基礎(chǔ)．

［1］ 王志本，梁家驥. 發(fā)菜生態(tài)和形態(tài)的近年研究[J]. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1989，20(2)：250-259.

［2］ 牛建章. 發(fā)菜的生物學(xué)特性與保護(hù)利用對(duì)策[J]. 草業(yè)與畜牧，2009(1)：59-62.

［3］ 姜翠萱. 淺談發(fā)菜[J]. 寧夏大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1981，3(2)：93-97.

［4］ 唐進(jìn)年，趙明，張盹明，等. 發(fā)菜的生物學(xué)特性及資源保護(hù)[J]. 中國野生植物資源，2000，19(5)：20-24.

［5］ Oldiges M，Lütz S，Pflug S，et al. Metabolomics：Current state and evolving methodologies and tools [J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2007，76(3)：495-511.

［6］ 于海峰，賈士儒. 均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化發(fā)菜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件[J]. 生物加工工程，2010，8(4)：57-61.

［7］ Weckwerth W，Wenzel K，F(xiàn)iehn O. Process for the integrated extraction，identification and quantification of metabolites，proteins and RNA to reveal their co-regulation in biochemical networks [J]. Proteomics，2004，4(1)：78-83.

［8］ Lu Shuhuan，Wang Jiangxin，Niu Yanhong，et al. Metabolic profiling reveals growth related FAME productivity and quality of Chlorella sorokiniana with different inoculum sizes[J]. Biotechnology and Bioengineering，2012，109(7)：1651-1662.

［9］ Canelas A B，Ras C，Pierick A T，et al. Leakage-free rapid quenching technique for yeast metabolomics [J]. Metabolomics，2008，4(3)：226-239.

［10］ Maharjan R P，F(xiàn)erenci T. Global metabolite analysis：The influence of extraction methodology on metabolome profiles of Escherichia coli[J]. Analytical Biochemistry，2003，313(1)：145-154.

［11］ Dettmer K，Nurnberger N，Kaspar H，et al. Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies：Optimization of harvesting and extraction protocols[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2011，399：1127-1139.

責(zé)任編輯：郎婧

Comparison of Metabolites Extracting Methods from Liquid Cultured Nostoc flagelliforme

HAN Peipei，SUN Ying，DUAN Wenqian，SHI Tuo，JIA Shiru
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

With gas chromatography mass spectrometry(GC-MS)，two kinds of metabolites extracting methods of Nostoc flagelliforme were compared. After being washed and quenched，samples were extracted using the cold methanol method and methanol / chloroform method，respectively. The results suggested that the better extraction effect was achieved with the cold methanol method with the 50mg sample. Through this method，46,kinds of metabolites from Nostoc flagelliforme were detected and identified，including 19,kinds of organic acids，1,kind of inorganic acid，13,kinds of amino acids，4,kinds of amines，4,kinds of alcohols，and 5,kinds of sugar.

Nostoc flagelliforme；cyanobacteria；gas chromatography mass spectrometry(GC-MS)；metabolite；extracting methods

Q93

A

1672-6510(2014)01-0007-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.01.002

2013–05–29；

2013–07–12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31201405，31271809)；國家級(jí)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”資助項(xiàng)目(201210057008)

韓培培（1983—），女，山東人，講師；通信作者：賈士儒，教授，jiashiru@tust.edu.cn.