應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察光動力技術(shù)對單增李斯特菌菌膜的滅活作用

李紅愛，胡慧丹，鄧 曦，劉 爽，唐書澤，*，吳希陽，陳振強

（1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632；2.廣州皇上皇集團有限公司，廣東廣州510240；3.暨南大學(xué)光電工程系，廣東廣州510632）

應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察光動力技術(shù)對單增李斯特菌菌膜的滅活作用

李紅愛1，胡慧丹2，鄧 曦1，劉 爽1，唐書澤1，*，吳希陽1，陳振強3

（1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632；2.廣州皇上皇集團有限公司，廣東廣州510240；3.暨南大學(xué)光電工程系，廣東廣州510632）

以亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB）為光敏劑，采用光催化專用氙燈光源（光功率密度為200mW/cm2），通過激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察法探討了光動力殺菌技術(shù)（anti-microbial photodynamic technology，APDT）對單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）菌膜（biofiLM，BF）的滅活作用。結(jié)果表明，MB-APDT處理的LM BF經(jīng)過SYTO9/PI染色后在CLSM下觀察，滅活效果區(qū)分明顯。這一效果由平板菌落計數(shù)法得到進一步證實。光照20min，當(dāng)MB的濃度低至0.1μg/mL時，APDT對于生長8h的BF失活率達(dá)到99.7%；當(dāng)MB濃度為50μg/mL時，幾乎全部LM BF失活。當(dāng)MB濃度為1μg/mL時，光照5min即可使約99.6%生長8h的LM BF失活，也可使約78.7%生長36h的BF失活；當(dāng)光照時間為30min時，生長8h LM-BF失活率達(dá)到99.97%，而生長36h BF失活率也達(dá)到99.94%。MB-APDT對LM BF的滅活效果主要取決于MB濃度和光照時間，且殺傷作用非常顯著。

激光共聚焦掃描顯微鏡，單增李斯特菌，生物菌膜，亞甲基藍(lán)，光動力滅菌技術(shù)

某些病原微生物極易粘附于食品加工設(shè)施表面或死角處而形成生物菌膜[1]（biofiLM，BF），不但使其發(fā)生物理或化學(xué)等性能變化，而且造成食品污染，導(dǎo)致食品安全問題[2-3]。單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是四大食源性致病菌之一[4-5]，被認(rèn)為是食品加工系統(tǒng)中形成BF的主要致病菌[6]。BF是指浮游菌（planktonic cell）為了增強自身的生存能力，通過增殖、聚集并在介質(zhì)表面粘附，形成由嵌入的細(xì)菌、分泌的胞外多糖及蛋白質(zhì)等基質(zhì)構(gòu)成的被膜[7-9]。由于BF中的菌體能夠產(chǎn)生強烈的群體感應(yīng)（quorum sensing，QS），導(dǎo)致其比浮游菌具有更高的滅菌耐受性[10-11]。因此，尋找一種能夠有效滅活LM BF的方法具有更為重要的食品安全意義。

光動力殺菌是一種新型滅菌技術(shù)，它是指通過光敏劑選擇性富集于目標(biāo)細(xì)胞或組織（如病源菌），并結(jié)合適當(dāng)?shù)目梢姽獠ㄩL照射而激發(fā)產(chǎn)生一系列活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS），ROS通過氧化作用攻擊細(xì)胞結(jié)構(gòu)從而影響其正常生理功能，實現(xiàn)對目標(biāo)細(xì)胞有效滅活的一項新技術(shù)[12]。亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB）是目前唯一被批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用的光敏劑[13]，已被應(yīng)用于治療牙周炎、齲齒、亞硝酸鹽中毒[14]，以及處理新鮮冷凍血漿等[15]。

本實驗選用單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19111作為實驗菌株，以亞甲基藍(lán)作為光敏劑，采用光催化專用氙燈光源，使用激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）和細(xì)菌平板菌落計數(shù)法觀察不同MB濃度、不同光照時間對不同生長階段LM BF的光滅活效果，CLSM觀察法通過區(qū)別菌體顏色，即可清晰比較BF在不同光滅活條件下處理效果。以期光動力殺菌技術(shù)可作為一種安全有效的非熱生物菌膜滅活技術(shù)應(yīng)用于食品加工設(shè)備及食品加工環(huán)境的消毒滅菌中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LM標(biāo)準(zhǔn)株ATCC19111 廣州市微生物研究所；亞甲基藍(lán)（MB） 上海紅綠光敏劑研究所有限公司；細(xì)菌計數(shù)培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；活-死細(xì)胞染色試劑盒Biovision。

LSXSS-500型500W光催化專用氙燈光源（光功率密度200mW/cm2） 北京卓立漢光儀器有限公司；LSM700型激光共聚焦掃描顯微鏡 德國Zeiss。

1.2 菌種培養(yǎng)及前處理

將活化的LM接種于5mL TSB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期（約12～14h）；以4500r/min離心10min，棄上清液，重新懸浮菌體于0.1mol/L的無菌磷酸緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS；pH= 7.4）中，調(diào)整其OD600=0.5左右。

1.3 CLSM對MB-APDT處理效果的觀察

1.3.1 MB濃度實驗 在6孔平底板（放置了經(jīng)清洗滅菌的18mm×18mm蓋玻片）中加入5mL TSB培養(yǎng)基（含0.45%葡萄糖[16]），再加入50μL按照1.2制備的菌懸液，在37℃靜置培養(yǎng)24h，小心取出載玻片，用無菌水洗數(shù)次以去除浮游菌；將蓋玻片移置干凈6孔平底板中，加入不同濃度的MB（0、0.1、1.0、10μg/mL），37℃避光孵育30min，將96孔板放置于氙燈光源前20cm處，照射20min。同時設(shè)置對照組（不光照組：L-）。將MB-APDT處理后的蓋玻片樣品用PBS緩沖液漂洗一遍，以去除殘留的MB；按照活-死細(xì)胞染色試劑盒（含SYTO9/PI兩種熒光染液）的說明步驟操作，把SYTO9/PI染液加在蓋玻片樣品上，37℃孵育15min，用抗熒光淬滅封片液封片后，置激光共聚焦掃描顯微鏡LSM700下于63×/1.4油鏡觀察，并采集光學(xué)圖像。

1.3.2 光照時間實驗 LM BF處理同步驟1.3.1，加入濃度為1μg/mL MB，37℃避光孵育30min，將96孔板放置于氙燈光源前20cm處，分別照射0、1、10、20min。同時設(shè)置對照組（不加光敏劑組：S-）。后續(xù)使用激光共聚焦掃描顯微鏡LSM700采集圖像實驗步驟同1.3.1。

1.4 APDT對LM BF的滅活實驗

1.4.1 MB濃度實驗 取10μL按照步驟1.2制備的菌懸液接種到有200μL TSB培養(yǎng)基（含0.45%葡萄糖）的96孔板中，在37℃培養(yǎng)分別培養(yǎng)0、8、12、18、24、36h，吸出菌懸液，用無菌水洗數(shù)次以去除浮游菌；加入不同濃度的MB（0、0.01、0.1、1、10、50μg/mL），37℃避光孵育30min，將96孔板放置于氙燈光源前20cm處，照射20min。同時設(shè)置對照組（不光照組：L-）。

1.4.2 光照時間實驗 LM BF前期培養(yǎng)與處理同步驟1.4.1，加入濃度為1μg/mL MB，37℃避光孵育30min，將96孔板放置于氙燈光源前20cm處，分別照射0、1、5、10、20、30min。同時設(shè)置對照組（不加光敏劑組：S-）。

1.4.3 細(xì)菌平板菌落計數(shù) 按照1.4.1和1.4.2不同方式處理后，將96孔杯放入超聲振蕩儀中，振蕩（2.5× 104Hz）30s，間隔30s，重復(fù)三次，使得BF完全從96孔杯壁及底部脫落下來，分散于菌懸液中。將所得的菌懸液均以1∶10梯度稀釋，各取100μL梯度稀釋液涂板于細(xì)菌計數(shù)培養(yǎng)基平板中，于37℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，48h后取出進行菌落計數(shù)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

式中，N為對照組菌落數(shù)平均值；n為實驗組菌落數(shù)平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MB-APDT對LM BF效果的可視化

MB-APDT對生長24h的LM BF的滅活效果使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，結(jié)果如圖1和圖2所示。圖1表示不同MB的濃度在氙燈光源下光照20min，對LM BF滅活作用的可視圖。圖2表示當(dāng)MB的濃度為1μg/mL時，通過不同光照時間的照射對LM BF的滅活作用可視圖。細(xì)胞經(jīng)過SYTO9/PI熒光染液處理后，經(jīng)488nm激發(fā)波長激發(fā)，活菌表征綠色，死菌表征紅色，處于凋亡后期的菌體表征黃色。因此，MB-APDT對LM BF的殺傷效果通過圖1和圖2中菌體顏色的觀察，即可清晰比較BF在不同光滅活條件下處理效果。

由圖1可知，當(dāng)光敏劑濃度為0.1μg/mL，光照20min時，部分菌體呈現(xiàn)出紅色，大部分為黃綠色，即生物菌膜中的部分菌體死亡，大部分菌體處于凋亡后期狀態(tài)；當(dāng)MB濃度為1μg/mL時，大部分菌體呈現(xiàn)出紅色，即BF中的大部分菌體已死亡；當(dāng)MB濃度為10μg/mL時，只有極少數(shù)幾個菌體呈現(xiàn)綠色，即幾乎所有的菌體都凋亡；而空白對照組（A）中菌體基本上全為綠色，表征全是活菌。

圖1CLSM觀察LM BFFig.1 Confocal laser scanning micrographs of L.monocytogenes biofilms

由圖2可見，當(dāng)亞甲基藍(lán)的濃度為1μg/mL時，光照1min，菌體部分仍呈綠色，大部分呈紅色，即BF中菌體死亡數(shù)量可觀；光照10min，大部分菌體已呈紅黃色或紅色，菌體死亡數(shù)量明顯；光照20min，大部分菌體呈現(xiàn)出紅色，只有極少數(shù)菌體為綠色，即大部分菌體已經(jīng)被滅活。

圖2CLSM觀察LM BFFig.2 Confocal laser scanning micrographs of L.monocytogenes biofilms

2.2 MB濃度對LM BF APDT滅活作用的量化結(jié)果

光照20min，不同濃度MB對不同生長階段的LM BF光動力滅活作用見圖3。由圖3可見，在相同光照條件下，隨著MB濃度的增加，APDT對LM BF的殺傷作用逐漸增強；當(dāng)使用同一MB濃度時，生長時間越短的BF，APDT對其滅活率越大，數(shù)量級降低越明顯。當(dāng)MB的濃度低至0.1μg/mL時，光照20min，APDT對于生長8h的BF失活率達(dá)到99.7%；對于培養(yǎng)36h BF殺傷率達(dá)到77.6%。當(dāng)MB濃度為50μg/mL時，幾乎全部LM BF都被滅活。因此，MB對LM BF能達(dá)到良好的光動力殺傷效果，而光敏劑對照組和光照對照組均沒有明顯的滅活作用。

2.3 光照時間對LM BF APDT滅活作用的量化結(jié)果

圖3 不同濃度MB對LM BF失活率的影響Fig.3 The effect of MB concentration on inactivation rate of L.monocytogenes biofilms

圖4表示當(dāng)MB的濃度為1μg/mL時，不同光照時間對不同生長階段的LM BF光動力滅活作用的影響。光照5min即可使約99.6%的生長8h LM BF失活也可使約78.7%的生長36h BF失活；當(dāng)光照時間為30min時，生長8h LM BF失活率達(dá)到99.97%，生長36h BF失活率也達(dá)到99.94%。表明當(dāng)MB濃度一定時，APDT對LM BF的殺傷作用隨著光照時間的延長而增強。

本課題組前期研究已經(jīng)證實APDT對浮游LM[17]具有顯著的殺菌效果。本實驗進一步證實APDT對于結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、對常用殺菌方法抵抗力更強的BF也有非常強的滅活作用。但相較于浮游的LM，要達(dá)到相同的滅活效果，僅需要MB的濃度為0.2μg/mL，同樣光源下光照10min。即相對于浮游菌，使LM BF滅活需要更高濃度的光敏劑和更長的光照時間，這與Buchovec等[18]的研究結(jié)果基本相似。Buchovec等[18]研究結(jié)果，以5-氨基酮戊酸（ALA）為光敏劑對LM浮游菌及LM BF進行光動力滅菌，BF所需的光敏劑濃度比浮游LM使用的濃度更高，光照時間更長。本實驗通過MB-APDT對不同生長階段的LM BF殺傷效果的比較，說明LM BF生長時間更長就越難以被消滅與控制。實驗結(jié)果與Lizcano等[19]關(guān)于肺炎鏈球菌BF形成的研究相吻合，從浮游菌到BF是一個菌體數(shù)量由少到多的聚集與增殖，菌膜結(jié)構(gòu)由簡單到繁雜的生長過程，也說明BF可能產(chǎn)生污染的機率比浮游菌更大，污染范圍更廣、程度更嚴(yán)重。

圖4 不同光照時間對LM BF失活率的影響Fig.4 The effect of illumination time on inactivation rate of L.monocytogenes biofilms

3 結(jié)論

亞甲基藍(lán)對不同生長階段的單增李斯特菌生物菌膜有著非常顯著的光動力滅活作用，其效果主要取決于光敏劑濃度和光照時間的影響。通過從激光共聚焦掃描顯微鏡觀察法反映MB-APDT對LM BF的滅活結(jié)果中顏色分析，可以直觀比較BF在不同光滅活條件下的處理效果。在同一光照時間下，MB的濃度越大，光動力滅活作用越顯著；當(dāng)MB濃度一定時，APDT殺傷作用隨著光照時間的延長而增強；在同一MB-APDT條件下，生長時間越短的BF，APDT對其造成的失活率越大，數(shù)量級降低越明顯。

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Using confocal laser scanning microscope visualizing the effect of anti-microbial photodynamic technology against Listeria monocytogenes biofilms

LI Hong-ai1，HU Hui-dan2，DENG Xi1，LIU Shuang1，TANG Shu-ze1，*，WU Xi-yang1，CHEN Zhen-qiang3
（1.Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China；2.Guangzhou Huangshanghuang Group Co.，Ltd.，Guangzhou 510240，China；3.Department of Optoelectronic，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

The efficacy of anti-microbial photodynamic technology（APDT）against Listeria monocytogenes（LM）biofilm（BF）by methylene blue（MB）under photocatalysis-xenon lamp light（power density 200mW/cm2）was visualized using confocal laser scanning microscope（CLSM）and investigated by counting colony-forming units（CFU）.Obtained results indicated that the efficacy of MB-APDT to LM BF was clearly visual through CLSM based on SYTO9/PI staining.In addition，standard plate counts of cells recovered from biofilms were used to quantify the effects of MB-photoactivated.The inactivation rate of cultured 8h LM BF was over 99.7% by 0.1μg/mL MB and 20min of irradiation，exposure to 50μg/mL MB resulted in almost complete killing.When the concentration of MB was 1μg/mL at the illumination for 5min，cultured 8h BF produced 99.6%inactivation while cultured 36h BF was only 78.7%.The ability of inactivate biofilm bacteria was further enhanced at the illumination for 30min，99.96%inactivation rate of cultured 8h BF and 99.94%of cultured 36h BF，respectively. The efficacy of MB-APDT to LM BF mainly depends on the concentration of MB and illumination time，and LM BF were effectively inactivated.

confocal laser scanning microscope（CLSM）；Listeria monocytogenes（LM）；biofilm（BF）；methylene blue（MB）；anti-microbial photodynamic technology（APDT）

TS207.3

A

1002-0306（2014）04-0157-04

2013－06－13 *通訊聯(lián)系人

李紅愛（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全。

廣東省自然科學(xué)基金項目（S2012010008479）；廣東省突發(fā)公共事件應(yīng)急技術(shù)研究中心專項（[2011]733）。