鎖擲酵母中圓酵母素穩(wěn)定性的研究

施秋妤，汪何雅，錢 和

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

鎖擲酵母中圓酵母素穩(wěn)定性的研究

施秋妤，汪何雅，錢 和*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

研究了鎖擲酵母中圓酵母素的穩(wěn)定性，以色素保留率和其全反式構(gòu)型百分含量為指標(biāo)，測定了其在光照、空氣及溫度條件下的變化。結(jié)果表明，隨著溫度升高，圓酵母素?fù)p失加劇，溫度在80～121℃范圍時，褪色加快，此時50%～90%的全反式構(gòu)型向順式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變；色素在光照條件下很不穩(wěn)定，陽光直射時色素氧化降解迅速；充入空氣貯存7d后，90%的圓酵母素發(fā)生氧化降解，但其對圓酵母素保留率的影響大于對其反式構(gòu)型含量的影響。進(jìn)一步得出，光、溫度和空氣對圓酵母素的保留率和全反式構(gòu)型的影響變化趨勢一致，光和溫度對色素全反式構(gòu)型影響較大，圓酵母素的異構(gòu)化主要受光和溫度影響。

鎖擲酵母，圓酵母素，幾何異構(gòu)體，穩(wěn)定性

類胡蘿卜素是一類廣泛存在于植物、動物及微生物（藻類，細(xì)菌及酵母等）中的天然色素。它不僅可以淬滅自由基、清除單線態(tài)氧，作為合成維生素A的前體物質(zhì)，還能增強(qiáng)人體免疫力，降低多種癌癥的發(fā)病率，因此常被應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。采用酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素具有營養(yǎng)要求簡單粗放、發(fā)酵周期短、生殖方式簡單等優(yōu)點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)[2]。已有研究報(bào)道鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus）富含β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、圓酵母素以及紅酵母紅素，但國內(nèi)外關(guān)于圓酵母素的報(bào)道非常少[3]。

圓酵母素（torulene）是一種只有碳?xì)浣M成的類胡蘿卜素（圖1），具有13個共軛雙鍵，其共軛烯烴長鏈一端具有可以轉(zhuǎn)化為VA活性的β-芷香環(huán)，另一端具有與番茄紅素相似的結(jié)構(gòu)特性，其功能活性值得深入研究；再者，目前圓酵母素已有成熟的菌株（Sporidiobolus pararoseus）可以進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)用前景較為可觀。而類胡蘿卜特有的共軛多聚烯結(jié)構(gòu)使其穩(wěn)定性相對較差，在光照、氧等條件下易氧化和異構(gòu)化，從而導(dǎo)致褪色或吸收峰偏移等。本文通過光、氧和溫度對圓酵母素穩(wěn)定性的影響，確定了其最佳貯藏條件，此研究對于確保提取、加工及貯藏過程中色素的穩(wěn)定性及防止氧化損失具有重要參考價值[4-5]，奠定了其后續(xù)功能活性深入探究的理論基礎(chǔ)。

圖1 全反式圓酵母素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 All-trans-torulene chemical structure

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus） 由本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得；甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）、甲基叔丁基醚（MTBE） 均為色譜純，美國Tedia公司；正己烷、石油醚（30～60℃）、丙酮 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HITACHI Chromaster高效液相色譜儀 日本，包括CM-5110四元泵，CM-5210自動進(jìn)樣器，CM-5310柱溫箱和CM-5430二極管陣列檢測器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 圓酵母素的提取、分離和純化 類胡蘿卜素為鎖擲酵母的胞內(nèi)色素，參考并改進(jìn)前人的方法[1，6]，采用酸熱破壁法。將鎖擲酵母發(fā)酵液離心后收集得到的菌體置于2mol/L HCl中，沸水浴煮沸5min，迅速冰浴冷卻。將破壁的菌體置于分液漏斗中，棄去下層，所得上層液體中加入丙酮，搖勻，然后加正己烷萃取攪拌，收集上層粗色素混合液，并用蒸餾水洗去雜質(zhì)，重復(fù)此步驟至細(xì)胞色淺或無色。粗提液減壓濃縮后-20℃充氮保存。

濃縮的粗提液進(jìn)行硅膠柱層析分離，梯度洗脫。具體洗脫條件參照李曉芹等[3]的方法，純化并制備圓酵母素。整個純化過程均在弱光條件下進(jìn)行。圓酵母素洗脫液減壓濃縮并加入0.1%BHT，-60℃充氮保存防止色素氧化降解。

1.2.2 圓酵母素的高效液相分析

1.2.2.1 C18-HPLC檢測分析純化的圓酵母素 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6mm×250mm，5μm），流動相洗脫條件參照并優(yōu)化Davoli等[7]的研究。流動相A為乙腈∶水∶甲酸（86∶10∶4，v/v/v），流動相B為乙酸乙酯∶甲酸（96∶4，v/v）；梯度洗脫：0～25min，A由100%降至0，25～30min，B由100%降至0；25～32min，A回復(fù)至100%；流速：1.0mL/min，檢測波長：450nm。

1.2.2.2 濃鹽酸化學(xué)定性[8]取2支試管，各加入圓酵母素的石油醚溶液10mL，另各加入9mL甲醇，然后在第一管加入1mL濃鹽酸，第二管加入1mL水，搖勻后觀察1h，觀察顏色的變化。

1.2.2.3 C30-HPLC分離圓酵母素幾何異構(gòu)體 色譜柱：YMC C30（4.6×250mm，5μm），通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)改進(jìn)建立的優(yōu)化洗脫方法。流動相A為甲醇∶甲基叔丁基醚∶水（50∶47.5∶2.5，v/v/v），流動相B為甲醇∶甲基叔丁基醚∶水（8∶90∶2，v/v/v）；梯度洗脫：0～25min，保持A為100%，B為0，10min內(nèi)A降至85%，20min內(nèi)B由15%線性升至55%并保持到運(yùn)行結(jié)束；檢測波長：485nm，DAD光譜收集范圍：200～600nm。

1.2.3 圓酵母素保留率和其全反式構(gòu)型（all-trans）百分含量的測定 圓酵母素保留率采用HPLC測定。洗脫條件同上述1.2.2.1。圓酵母素保留率為實(shí)驗(yàn)條件下樣品的圓酵母素含量和實(shí)驗(yàn)開始時含量的比值，即為HPLC所測得的實(shí)驗(yàn)條件下和初始條件的圓酵母素峰面積之比；全反式構(gòu)型占純化所得圓酵母素所有幾何異構(gòu)體的百分含量亦采用高效液相色譜法測定。洗脫條件如上述1.2.2.3，亦用峰面積之比表示。

1.2.4 溫度對圓酵母素穩(wěn)定性的影響 食品加工中常用的熱處理方式有巴氏殺菌、阿氏殺菌等，因此選擇以下5個溫度作為考察對象。取10mL DMSO色素溶液分別置于40、60、80℃條件下水浴，恒溫箱中100℃和121℃恒溫加熱，每隔一段時間定時取樣，平行三次。

1.2.5 光對圓酵母素穩(wěn)定性的影響 取10mL正己烷色素溶液于螺旋口玻璃瓶中，分別取室內(nèi)日光燈照射、室外陽光直射、室內(nèi)自然光、室內(nèi)避光和4℃避光5個處理。每隔一段時間取樣，平行三次。

1.2.6 空氣對圓酵母素穩(wěn)定性的影響 取10mL正己烷色素溶液分別取室溫25℃敞口、密封及充氮保存3個處理，每天將敞口的圓酵母素溶液補(bǔ)足溶劑并定時取樣。平行三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC（C18）檢測純化圓酵母素

李曉芹等[3]已鑒定鎖擲酵母中富含β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、圓酵母素以及紅酵母紅素四種主要色素。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過硅膠柱層析分離純化及高效液相色譜分析所得圓酵母素的C18-HPLC色譜圖及對應(yīng)紫外光譜掃描圖如圖2所示，（A）中1號液相峰對應(yīng)了（B）中類胡蘿卜素特有的“三指形”吸收峰（圖2（B）），一個主峰及兩個肩峰的吸收分別在484、460、516nm（石油醚），這與文獻(xiàn)報(bào)道的圓酵母素在石油醚中的最大吸收峰485、460、518nm基本一致[9]，進(jìn)一步鑒定柱層析分離純化所得為圓酵母素。Iriani等[10]報(bào)道圓酵母素順式吸收主要在380nm左右，與圖2（B）中近紫外區(qū)域出現(xiàn)的380nm處的特征順式峰一致，為圓酵母素幾何異構(gòu)體的分離提供了理論依據(jù)。1號主液相峰旁邊幾乎被基線掩蓋的小峰根據(jù)DAD光譜數(shù)據(jù)（與1號主峰的最大吸收峰相比，藍(lán)移5～10nm左右）被認(rèn)為是圓酵母素的順式異構(gòu)體。

2.2 濃鹽酸化學(xué)定性

圖2 色譜圖Fig.2 Chromatogram

取2支試管，各加入圓酵母素的石油醚溶液10mL，另各加入9mL甲醇，然后在第一管加入1mL濃鹽酸，第二管加入1mL水，搖勻后觀察1h，無顏色的變化。表明分子結(jié)構(gòu)中沒有環(huán)氧結(jié)構(gòu)。推斷得出，圓酵母素在純化過程中未產(chǎn)生環(huán)氧化物，便于圓酵母素幾何異構(gòu)體的分析。

2.3 HPLC（C30）-DAD分離鑒定圓酵母素幾何異構(gòu)體

由于C30與C18固定相相比具有更長的烷基鏈，大致與類胡蘿卜素分子長度相當(dāng)，導(dǎo)致固定相的疏水性增強(qiáng)，從而延長類胡蘿卜素的保留時間，提高柱效，有利于其順、反式幾何異構(gòu)體的良好分離[11]。圖3中共分離得到8種圓酵母幾何異構(gòu)體，與全反式異構(gòu)體相比，類胡蘿卜素順式異構(gòu)體的主要電子吸收光譜特征表示：a.最大吸光值所在波長（λmax）略有紫移（2～20nm，視溶劑而異）；b.“順式吸收峰”（cis-peak）有明顯加強(qiáng)，且異構(gòu)位置越靠近中心，此峰越高[12-13]。由于至今未有文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)圓酵母素順式異構(gòu)體的光譜數(shù)據(jù)，我們無法確定發(fā)生順式轉(zhuǎn)變的雙鍵的具體位置。我們初步判定1～7號峰為圓酵母素的順式異構(gòu)體，而8號峰未出現(xiàn)順式峰（表1），且其三指形吸收峰與文獻(xiàn)報(bào)道全反式-圓酵母素?cái)?shù)值相近，因此判斷其為全反式-圓酵母素[10]。2.4 外界環(huán)境處理對圓酵母素穩(wěn)定性的影響

圖3 鎖擲酵母中圓酵母素順反異構(gòu)體分離的C30-HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of cis/trans isomers of torulene separated on with a YMC C30column from Sporidiobolus pararoseus

表1 圓酵母素幾何異構(gòu)體的保留時間、光譜數(shù)據(jù)及百分含量（與圖2對應(yīng)）Table.1 Retention time and UV-visible spectral characteristics of torulene geometrical isomers corresponding to Figure 2

不同光、氧和溫度條件處理會不同程度地引起圓酵母素氧化降解以及異構(gòu)化反應(yīng)，共同反映了圓酵母素對外界環(huán)境處理的穩(wěn)定性。因此，本文分別以圓酵母素保留率和其反式構(gòu)型百分含量作為表征指標(biāo)，全面地研究圓酵母素的穩(wěn)定性。

圖4 溫度對圓酵母素保留率和其全反式構(gòu)型比例的影響Fig.4 Effect of temperature on the retention rate of torulene and percent of all-trans-torulene among torulene geometrical isomers

2.4.1 溫度對圓酵母素保留率和其全反式構(gòu)型的影響 圖4（A，B）為溫度對圓酵母素保留率的影響，隨著溫度的升高，圓酵母素的DMSO（沸點(diǎn)189℃）溶液的保留率逐漸下降。40～60℃處理對色素的破壞較小，色素保留率分別從100%降至89%和80%，但溫度升至80℃時，色素迅速氧化降解，4h處理后保留率小于30%，100、121℃處理時，95%左右圓酵母素都已經(jīng)損失；全反式結(jié)構(gòu)是類胡蘿卜素幾何異構(gòu)體中最穩(wěn)定的構(gòu)型，其百分含量的高低間接反映了其穩(wěn)定性變化。圖4（C，D）為溫度對圓酵母素中全反式構(gòu)型百分含量的影響，其變化趨勢基本與色素保留率變化一致，40、60、80℃分別處理4h后，其全反式構(gòu)型百分含量從63%左右降至59%、51%和27%，100、121℃處理100min后，圓酵母素全反式構(gòu)型百分含量則降至15%和5%。

2.4.2 光對圓酵母素保留率和其全反式構(gòu)型的影響

圖5為光對圓酵母素保留率的影響，色素對陽光和日光燈光較為敏感，尤以陽光更為顯著，經(jīng)陽光直射3h后圓酵母素保留率為23%，這可能是由于紫外光和溫度的雙重效應(yīng)引起的；其次，色素對日光燈光也不太穩(wěn)定，相比而言，室內(nèi)自然光則較為柔和，因此色素?fù)p失相對要緩慢的多。色素對光的這種敏感性是由于類胡蘿卜素分子內(nèi)部不飽和雙鍵等特殊結(jié)構(gòu)在光作用下自身的氧化分解，從而導(dǎo)致雙鍵消失，使得吸收光譜發(fā)生變化，吸收波長不再出現(xiàn)于可見區(qū)域，其感官變化就是色素褪色[5，14]。當(dāng)處于同等避光條件下，25℃與4℃不同的處理對圓酵母素保留率影響較小，無顯著差異，儲藏14d后色素保留率均在85%左右，色素在低溫（4℃）下更為穩(wěn)定；表2、表3反映了陽光直射處理180min后，全反式-圓酵母素從原先的62%降至17%，整個體系處于非常不穩(wěn)定的狀態(tài)。日光燈光照射3h后，全反式構(gòu)型降至41.90%，順式結(jié)構(gòu)在圓酵母素幾何構(gòu)型中占主體，說明圓酵母素對日光燈光很不穩(wěn)定。自然光對圓酵母素全反式構(gòu)型影響較小，儲存14d后全反式構(gòu)型百分含量從64%降至51%左右，25℃避光與4℃避光相比，全反式構(gòu)型百分含量略有提高，說明低溫冷藏可增強(qiáng)圓酵母素穩(wěn)定性。可見圓酵母素在光照條件下極其不穩(wěn)定，因此在提取及加工過程中應(yīng)盡量避光。

圖5 光對圓酵母素保留率的影響Fig.5 Effect of light on the retention rate of torulene

表2 日光燈光和陽光照射對圓酵母素全反式構(gòu)型百分含量的影響（%）Table.2 Effect of fluorescent lamp and sunshine on the percent of all-trans-torulene among torulene geometrical isomers（%）

表3 室內(nèi)自然光對圓酵母素全反式構(gòu)型百分含量的影響（%）Table.3 Effect of room light on the percent of all-trans-torulene among torulene geometrical isomers（%）

2.4.3 空氣對圓酵母素保留率和其全反式構(gòu)型的影響 空氣對圓酵母素保留率的影響大于對其反式構(gòu)型含量的影響（圖6和表4），可能由于氧氣引起圓酵母素的氧化降解反應(yīng)大于其異構(gòu)化效應(yīng)。充入空氣7d后，90%的圓酵母素發(fā)生氧化降解，但其全反式構(gòu)型百分含量維持在54%左右；充入氮?dú)夂螅A藏7d后圓酵母素保留率與對照組相比從71%增至81%，由于氮?dú)飧艚^了氧氣，因此在一定程度上起到了良好的保護(hù)作用，但其對圓酵母素全反式構(gòu)型百分含量并無明顯保護(hù)作用，變化趨勢基本與對照組一致。

圖6 空氣對圓酵母素保留率的影響Fig.6 Effect of air on the retention rate of torulene

表4 空氣對圓酵母素全反式構(gòu)型百分含量的影響（%）Table.4 Effect of air on the percent of all-trans-torulene among torulene geometrical isomers（%）

3 結(jié)論

3.1利用YMC C30柱和梯度洗脫，建立HPLC-DAD分離檢測鎖擲酵母中圓酵母素同分異構(gòu)體的方法，共分離得到7種順式和1種全反式異構(gòu)體，且全反式構(gòu)型占64%左右。

3.2光、溫度和空氣對圓酵母素的保留率和全反式構(gòu)型的影響趨勢一致，光和溫度對色素全反式構(gòu)型影響較大，進(jìn)一步驗(yàn)證了類胡蘿卜素的異構(gòu)化主要受光和溫度影響，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。

3.3圓酵母素對60℃以下的溫度較為穩(wěn)定，但對80℃及以上的溫度非常不穩(wěn)定，此時50%～90%的全反式構(gòu)型消失，逐漸向順式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變；色素對光也很敏感，圓酵母素保留率和全反式構(gòu)型的穩(wěn)定性為：陽光＜日光燈光＜室內(nèi)自然光＜避光；圓酵母素敞口（充入空氣）貯藏14d，幾乎完全失去顏色，充入氮?dú)饽軠p緩圓酵母素的氧化降解。綜上所述，圓酵母素應(yīng)在低溫、避光、充氮或加入適量抗氧化劑（如BHT）的環(huán)境下保存。

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Study on the stability of torulene from Sporidiobolus pararoseus

SHI Qiu-yu，WANG He-ya，QIAN He*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The torulene stability from Sporidiobolus pararoseus was studied in this paper.The retention rate of total torulene and percent of all-trans torulene among torulene geometrical isomers were determined under different conditions，such as light，oxygen and temperature.The results showed that torulene had a great loss with the increasing temperature and faded intensified when the temperature reached 80～121℃ and about percent of 50 to 70 of total all-trans torulene configuration gradually transformed to cis-torulene isomers at that time；Torulene was quite unstable under light and degraded rapidly especially in direct sunlight；Percent of 90 torulene experienced oxidation and degradation after storage for a week filled with air which had an insignificant effect on the percentage of all-trans configuration of torulene.We have further concluded that light，oxygen and temperature had the same trend on the effect of total torulene retention rate and all-trans torulene relative percentage，and torulene isomerization was mainly affected by light and temperature.

Sporidiobolus pararoseus；torulene；geometrical isomers；stability

TS201.2

A

1002-0306（2014）04-0135-05

2013－07－05 *通訊聯(lián)系人

施秋妤（1989-），女，碩士研究生，研究方向：天然色素的研究。

國家科技支撐項(xiàng)目（2012BAD36B02）。