鐵皮石斛多糖分離純化及單糖組成測(cè)定

賓宇波，王亞蕓，安 欣，任建武，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京100083；2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京林業(yè)大學(xué)），北京100083）

鐵皮石斛多糖分離純化及單糖組成測(cè)定

賓宇波1，2，王亞蕓1，2，安 欣1，2，任建武1，2，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京100083；2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京林業(yè)大學(xué)），北京100083）

將鐵皮石斛粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離得到了四個(gè)多糖組分（DO-1、DO-2、DO-3、DO-4），并將組分DO-1經(jīng)Sephadex G-200柱純化得到多糖DOP。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化方法進(jìn)行高效液相色譜分析，分析結(jié)果得出，多糖DOP由D-甘露糖、L（+）-鼠李糖和D-葡萄糖三種單糖組成，通過外標(biāo)法定量得知D-甘露糖∶L（+）-鼠李糖∶D-葡萄糖=1.936∶0.856∶0.691。測(cè)定了多糖DOP抗氧化活性，結(jié)果顯示其具有良好的清除能力。

鐵皮石斛，DEAE-cellulose-52纖維素柱，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），高效液相色譜

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是一種名貴的中藥材，自古以來就有“藥中黃金”之稱，民間稱之為“救命仙草”[1]，主要生長在我國西南和江南各省[2]。鐵皮石斛對(duì)熱病傷陰、胃陰不足等病癥有很好療效；對(duì)慢性萎縮性胃炎以及心腦病患、防癌抗癌、防老抗衰等方面，石斛都具有獨(dú)特、滿意的效果[3-4]。多糖是鐵皮石斛中最主要的有效成分[5]，具有很強(qiáng)的藥理活性[6-7]。分析多糖中單糖的組成為多糖藥理活性的研究能夠提供一定的研究基礎(chǔ)[8]，為進(jìn)一步深入探究鐵皮石斛具有重要意義。

鐵皮石斛多糖的單糖組成的分析是其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系研究的一項(xiàng)基本且重要的內(nèi)容。但是由于單糖的極性比較強(qiáng)，并且結(jié)構(gòu)相近，缺乏光學(xué)活性，因此為了改善單糖分離的選擇性和提高檢測(cè)的靈敏度，很多文獻(xiàn)將多糖水解后應(yīng)用柱前或柱后衍生化色譜法分離和檢測(cè)[9-12]。其中1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化高效液相色譜法反應(yīng)條件較溫和，產(chǎn)物無立體異構(gòu)，紫外檢測(cè)靈敏度較高，故得到較為廣泛的應(yīng)用[13-16]。本研究比較了不同反應(yīng)時(shí)間的衍生產(chǎn)物峰面積的大小和不同流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響，建立了PMP柱前衍生化高效液相色譜測(cè)定單糖的方法，并首次測(cè)定了鐵皮石斛多糖通過DEAE-cellulose-52纖維素柱的純水洗脫部分的單糖組成。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛 購于浙江瑞心源生物科技有限公司，60℃烘干后，粉碎，過50目篩備用；DEAE-cellulose-52填料 Whatman公司；Sephadex G-200填料Pharmacia公司；石油醚、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖 Sigma公司；D-阿拉伯糖、L（+）-鼠李糖 Fluka公司；D-木糖 上海伯奧生物科技有限公司；D-甘露糖 上海試劑二廠；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 純度99%，美國Acros Organics公司。

MNMF-1818型谷物粉碎機(jī) 湖北碧山機(jī)械有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海滬西分析儀器廠有限公司；722型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀 包括G1311A四元泵，G1315B DAD檢測(cè)器，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1379A在線脫氣機(jī)，G1316A柱溫箱，Agilent1100化學(xué)工作站，美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鐵皮石斛多糖提取工藝[6]稱取2g石斛粉末→石油醚脫脂，料液比1∶5（g/mL），1h，兩次→80%乙醇溶液100mL回流脫單糖（料液比1∶5，2h，兩次）→80%乙醇洗滌殘?jiān)?→100mL蒸餾水60℃水提，2h，兩次→合并兩次提取液上清液→Sevag法除蛋白→80%乙醇溶液沉淀→乙醇清洗沉淀→冷凍干燥沉淀→石斛粗多糖粉末。

1.2.2 鐵皮石斛粗多糖的分離純化 將凍干的粗多糖粉末用蒸餾水溶解配制成1g/10mL的粗多糖溶液，離心后取上清液過0.45μm濾膜，取0.5mL進(jìn)DEAE-52纖維素柱（1.5cm×60cm）進(jìn)行分離，先以蒸餾水洗脫，然后以0.1～0.8mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為0.3mL/min，以3mL每管收集洗脫液，用苯酚-硫酸法于490nm處測(cè)定每管洗脫液的吸光值，根據(jù)測(cè)定出的吸光值繪制洗脫曲線，合并主要洗脫峰的洗脫液，將其濃縮裝入透析袋（截流分子量為7000），在流水和蒸餾水中分別透析48、24h，醇沉，凍干得到4個(gè)組分（DO-1、DO-2、DO-3、DO-4），將組分DO-1用Sephadex G-200柱（2.5cm×80cm）進(jìn)一步純化，得到DOP純多糖組分。

1.2.3 混合單糖標(biāo)樣的衍生 分別取100μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液（各單糖質(zhì)量濃度均為0.36g/L左右）與100μL的0.6mol/L NaOH溶液，置于1mL的具塞試管中混合均勻，再從中吸取50μL的混合液于5mL的具塞試管中，加50μL 0.5mol/L的PMP（0.4355g/5mL）甲醇溶液，漩渦混勻；絕大多數(shù)文獻(xiàn)選用了70℃作為反應(yīng)溫度，但是對(duì)于反應(yīng)的時(shí)間執(zhí)不同的意見，本文設(shè)置了30、50、70、100、120min五個(gè)時(shí)間做為單糖的衍生化時(shí)間，以峰面積作為考察對(duì)象，以葡萄糖衍生化為例，考察不同的衍生化反應(yīng)時(shí)間，最終測(cè)得的峰面積。經(jīng)反應(yīng)后取出放置10min冷卻至室溫，加100μL 0.3mol/L的HCl中和；加水至1mL，再加等體積的氯仿，振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3次。將水相用0.45μm微孔膜過濾后供HPLC進(jìn)樣分析。

1.2.4 樣品的制備 稱取20mg多糖DOP置于試管中，加入2mol/L H2SO43mL，封管，100℃水解8h，然后用適量BaCO3中和，離心取上清液，得到多糖水解液。吸取水解液100μL和100μL的0.6mol/L NaOH溶液，置于1mL的具塞試管中混合均勻，再取50μL的混合液于5mL的具塞試管中，加50μL 0.5mol/L的PMP（0.4355g/5mL）甲醇溶液，漩渦混勻，在70℃烘箱中反應(yīng)40min，反應(yīng)后，按照1.2.3中方法進(jìn)行冷卻、中和、萃取，過0.45μm微孔膜過濾后供HPLC進(jìn)樣分析。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取D-葡萄糖、L（+）-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖分別配成1、2、3、4、5mg/10mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3中的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行衍生化，冷卻、中和、萃取后，過0.45μm微孔膜過濾后供HPLC進(jìn)樣分析，應(yīng)用Agilent 1100化學(xué)工作站制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18（250mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，pH6.9）（體積比為17∶83）、乙腈-超純水（體積比為17∶83）；柱溫：30℃；流速：1mL/min；檢測(cè)波長：250nm；進(jìn)樣體積：10μL。

1.2.7 多糖DOP溶液清除DPPH自由基能力的測(cè)定稱取多糖DOP樣品配制成不同濃度的溶液，取不同濃度的溶液2mL和2×10-4mol/L的DPPH自由基甲醇溶液2mL，加入同一具塞試管中，搖勻，在室溫避光反應(yīng)30min后于515nm處測(cè)其吸光度，并用VC溶液作為陽性對(duì)照，計(jì)算多糖DOP對(duì)DPPH自由基的清除率[17]，公式如下：

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中：A0為對(duì)照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度；i、j分別表示不同的實(shí)驗(yàn)組。

2 結(jié)果與討論

2.1 粗多糖的分離和純化

粗多糖經(jīng)過DEAE-52纖維素柱分離后，得到了4個(gè)組分，分別為DO-1、DO-2、DO-3和DO-4，如圖1所示。DO-1為純水洗脫下來的中性多糖部分，占據(jù)了石斛粗多糖的主要部分，其他3個(gè)組分分別為0.1、0.2、0.4mol/L的NaCl溶液洗脫下來的部分。將DO-1部分再經(jīng)過Sephadex G-200柱純化，得到DOP純多糖，經(jīng)透析、濃縮、醇沉、冷凍干燥得到純的多糖粉末。

2.2 衍生化時(shí)間及流動(dòng)相的選擇

圖1 石斛多糖洗脫曲線Fig.1 Elution curve of Dendrobium candidum polysaccharide

實(shí)驗(yàn)結(jié)論證明：在反應(yīng)時(shí)間為100min時(shí)，單糖衍生化物的峰面積最大，70min次之，120min時(shí)，單糖衍生化物峰面積下降較為明顯，故衍生化時(shí)間選擇為100min。

在流動(dòng)相的選擇方面，大多數(shù)文獻(xiàn)選擇了用乙腈-磷酸鹽緩沖液或乙腈-醋酸鹽作為流動(dòng)相，但是，鹽對(duì)于整個(gè)液相色譜儀和柱子有著很嚴(yán)重的影響，一般情況下，盡量不選擇鹽作為流動(dòng)相，因此，本文選擇了乙腈-磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，pH6.9）（體積比為17∶83）和乙腈-超純水（體積比為17∶83）作為本次實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相[14]，對(duì)比兩種不同流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明：乙腈-超純水（體積比為17∶83）作為流動(dòng)相同樣也能讓7種單糖的衍生化物得到很好的分離，并沒有出現(xiàn)拖尾和峰型不好看等現(xiàn)象（圖3），只是在出峰時(shí)間上比乙腈-磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，pH6.9）作為流動(dòng)相時(shí)稍晚，但并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果完好的前提下，選擇對(duì)儀器和柱子不產(chǎn)生損害性影響的乙腈-超純水（體積比為17∶83）作為流動(dòng)相比較適宜。

2.3 DOP多糖中單糖成分色譜分析

圖2 不同反應(yīng)時(shí)間峰面積變化曲線Fig.2 The curve of the peak area change withdifferent reaction time

圖3 7種單糖-PMP衍生化物色譜分離圖（乙腈-超純水體積比為17∶83）Fig.3 The chromatograms of seven kinds of monosaccharide-PMP compounds（ACN-Ultrapure water 17∶83）

圖4為DOP多糖水解、衍生化后，高效液相色譜分析的圖，從圖4中，可以看到一共得到了3個(gè)峰，通過與圖3混合標(biāo)樣的比較，可以知道這3個(gè)峰分別是D-甘露糖、L（+）-鼠李糖和D-葡萄糖，D-甘露糖占主要部分。圖5為外標(biāo)法制作的這3種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（依次為D-葡萄糖、L（+）-鼠李糖和D-甘露糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線），其中D-甘露糖的線性方程為y=81.79x+ 25.66，R2=0.998；L（+）-鼠李糖的線性方程為y=140.4x-49.26，R2=0.996；D-葡萄糖的線性方程為y=77.30x+ 17.13，R2=0.994。通過外標(biāo)法定量，可以得到DOP多糖中D-甘露糖∶L（+）-鼠李糖∶D-葡萄糖=1.936∶0.856∶0.691。2.4 多糖DOP清除DPPH自由基能力的測(cè)定

圖4 DOP多糖水解后衍生物色譜分離圖Fig.4 Chromatograms of PMP derivatives of acid hydrolyzates of polysaccharide DOP

圖5 D-葡萄糖、L（+）-鼠李糖和D-甘露糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard curve of D-mannose L（+）-rhamnose D-glucose

由圖6可以看出多糖DOP和VC都有著比較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力，并且隨著濃度的增加，其清除率也隨著增強(qiáng)，相較而言，VC比多糖DOP有著更強(qiáng)的清除能力，在濃度達(dá)到0.3mg/mL時(shí)，多糖DOP的清除率達(dá)到了50%以上，說明其能夠比較有效的清除DPPH自由，具有較強(qiáng)生理活性。

圖6 多糖DOP和VC清除自由基能力的比較Fig.6 Comparison of DPPH radical scavenging activity on polysaccharide DOP with vitamin C

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的水提醇沉提取多糖的工藝，得到脫除蛋白質(zhì)的鐵皮石斛多糖，并通過DEAE-52柱分離得到了4種多糖組分，通過Sephadex G-200柱純化得到了純的鐵皮石斛多糖組分DOP，建立了PMP柱前衍生化高效液相色譜分析單糖的方法，該方法靈敏度高且準(zhǔn)確可靠，測(cè)得多糖DOP中含有甘露糖、鼠李糖和葡萄糖3種單糖，并且通過清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)，得出其具有良好的清除能力，說明多糖DOP具有良好的抗氧化活性。

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Dendrobium polysaccharide purification and determination of monosaccharide composition

BIN Yu-bo1，2，WANG Ya-yun1，2，AN Xin1，2，REN Jian-wu1，2，*
（1.Department of Food Science and Engineering，College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2.Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

Polysaccharides of Dendrobium was isolated by DEAE-52 cellulose column and four kinds of polysaccharide（DO-1，DO-2，DO-3，DO-4）were got，then the component DO-1 was purified by Sephadex G-200 column，polysaccharide DOP was got.Using the method of pre-column derivatization with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone（PMP）for HPLC analysis and the results showed that，polysaccharides DOP was composed of D-mannose，L（+）-rhamnose and D-glucose，and the external standard informed that D-mannose∶L（+）-rhamnose∶D-glucose=1.936∶0.856∶0.691.The antioxidant properties of polysaccharide DOP were determined，and the results showed that the polysaccharide DOP had strong scavenging effects to DPPH radicals.

Dendrobium candidum；DEAE-52 cellulose column；1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone（PMP）；HPLC

TS201

A

1002-0306（2014）04-0122-04

2013－06－21 *通訊聯(lián)系人

賓宇波（1989-），男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯運(yùn)。

北京市園林綠化局計(jì)劃項(xiàng)目（Y1HH200900304）。