脂肪氧合酶催化亞油酸氧化對花生蛋白結(jié)構(gòu)的影響

廖 鈺，葉 林，趙謀明，孫為正

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510641）

脂肪氧合酶催化亞油酸氧化對花生蛋白結(jié)構(gòu)的影響

廖 鈺，葉 林，趙謀明，孫為正*

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510641）

利用脂肪氧合酶催化亞油酸氧化的反應(yīng)體系對花生分離蛋白進(jìn)行不同程度的氧化修飾，通過研究不同亞油酸含量下花生分離蛋白的羰基值、游離巰基含量、粒徑分布、表面疏水性、溶解度以及熒光光譜的變化規(guī)律，從而探討氧化對花生分離蛋白結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：隨著反應(yīng)體系中底物亞油酸含量的增加，花生分離蛋白的羰基值先增加后略微下降，游離巰基含量下降，表面疏水性先增加后減小，說明氧化后花生分離蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生了改變。其粒徑分布和溶解度的變化規(guī)律可以表征花生分離蛋白氧化聚集體的狀態(tài)，同時(shí)其熒光峰位λmax的變化規(guī)律可反映花生分離蛋白三級結(jié)構(gòu)的具體變化，表明脂肪氧合酶催化亞油酸氧化可以誘導(dǎo)花生分離蛋白分子發(fā)生聚集，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。

花生分離蛋白，脂肪氧合酶，氧化，結(jié)構(gòu)

脂肪氧合酶（LOX）是廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的一種酶，尤其是在豆科植物中含量豐富[1]。它具有直接催化含順，順-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸的能力，通過分子內(nèi)加氧，形成具有共軛雙鍵的氫過氧化衍生物[2]。這些氫過氧化物及其次生產(chǎn)物可與蛋白質(zhì)和氨基酸等發(fā)生反應(yīng)引起蛋白質(zhì)氧化[3]，是影響產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素之一。

花生蛋白因其豐富的營養(yǎng)價(jià)值廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。在加工和使用過程中，花生蛋白的功能性質(zhì)受到許多因素的影響，蛋白質(zhì)氧化是其中一個(gè)重要的因素。氧化修飾對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成的影響主要包括蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基酸的改變、蛋白質(zhì)的交聯(lián)與肽鏈斷裂、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的展開以及構(gòu)象的變化[4]。這些結(jié)構(gòu)變化最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值下降、生物活性降低以及功能性質(zhì)變化。近年來，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注食品中脂質(zhì)氧化與蛋白質(zhì)氧化之間的聯(lián)系。目前國內(nèi)外的相關(guān)課題主要圍繞動(dòng)物蛋白展開研究，而針對花生蛋白氧化的研究還未見報(bào)道。本文利用脂肪氧合酶催化亞油酸氧化的反應(yīng)體系對花生分離蛋白進(jìn)行不同程度的氧化修飾，通過針對氧化后花生分離蛋白的羰基值、游離巰基含量、粒徑分布、表面疏水性、溶解度以及內(nèi)源熒光光譜的分析，以期對脂肪氧合酶催化脂質(zhì)過氧化引起的花生蛋白氧化及其結(jié)構(gòu)變化提供理論依據(jù)，為抑制蛋白質(zhì)氧化奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂花生粕 山東天申生物蛋白有限公司產(chǎn)品；大豆 市售；脂肪氧合酶（710U/mg） 自制；Tween 20 化學(xué)純；亞油酸 色譜純；其他試劑 均為分析純。

pHS-25數(shù)顯pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；CS150NX超速離心機(jī) 日本HITACHI公司；SP-721可見分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司；Nano-ZS納米粒度分布儀 英國Malvern公司；F700熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生分離蛋白的制備 參考劉巖等[5]的方法，脫脂花生粕與水1∶10混合，以2mol/L NaOH調(diào)節(jié)體系pH至8.0，浸提1h后常溫3000×g離心15min，所得上清液以2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，離心后沉淀再用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，冷凍干燥，制得花生分離蛋白。

1.2.2 脂肪氧合酶的制備以及酶活的測定 制備方法[6]：大豆→粉碎→過40目篩→正己烷浸提→干燥→脫脂豆粕+水（料液比1∶11）攪拌→離心→上清液冷凍干燥→自制脂肪氧合酶。

酶活的測定參考黃友如等[7]的方法。取0.3mL 4mg/mL的酶液，加2mL底物乳狀液（2.24×10-3mol/L亞油酸分散于含0.5μL/mL Tween20的0.1mol/L，pH9.0的硼酸緩沖液）混勻后30℃水浴3min，加5mL無水乙醇終止反應(yīng)，再加5mL蒸餾水混勻，于234nm下測定反應(yīng)的吸光度。以1min內(nèi)2.3mL反應(yīng)體系在234nm的吸光度增加0.001作為一個(gè)酶活單位（U）。

1.2.3 氧化花生分離蛋白的制備 底物亞油酸溶液的配制[7]：取1.5g亞油酸于50mL容量瓶中，依次加入1mL 5mmol/L NaOH溶液，10mL 0.2mol/L，pH9.0的硼酸緩沖液以及2滴Tween20，搖勻后用0.2mol/L，pH9.0的硼酸緩沖液定容至50mL。酶液的配制：取1.02g自制脂肪氧合酶溶于51mL pH9.0的磷酸鹽緩沖液。

用去離子水配制5%的花生分離蛋白溶液，以2mol/L NaOH調(diào)節(jié)體系pH至9.0。分別稱取100g溶液于5個(gè)錐形瓶中，用數(shù)字1～5表示。在每個(gè)瓶中均加入10mL酶液，并分別加入0、3、4.5、7.5、9mL底物亞油酸溶液，振蕩搖勻，于4℃冰箱中培養(yǎng)6h后取出，以2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，離心（5000×g，30min），水洗沉淀并用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，冷凍干燥，制得氧化花生分離蛋白。

1.2.4 羰基值的測定 蛋白質(zhì)羰基值的測定參考Levine等[8]的方法，并稍作調(diào)整。用去離子水配制5mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，充分?jǐn)嚢韬箅x心（10000×g，20min），用雙縮脲法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量。取1mL上清液與3mL含有10mmol/L 2，4-二硝基苯肼的2mol/L HCl混合，常溫下避光放置1h，以1mL上清液與3mL 2mol/L HCl混合作空白對照，再加入1mL 50%的三氯乙酸，振蕩后靜置20min再離心（10000×g，20min），用乙醇-乙酸乙酯混合溶液（1∶1，v/v）洗滌沉淀3次。最后將沉淀溶解于3mL 6mol/L鹽酸胍溶液中，37℃水浴20min，待沉淀充分溶解后在367nm處比色，以22000M-1cm-1消光系數(shù)計(jì)算每mg蛋白質(zhì)羰基衍生物的摩爾數(shù)。

1.2.5 游離巰基含量的測定 游離巰基含量的測定參考Beveridge[9]改進(jìn)后的方法，并稍作調(diào)整。稱取15mg樣品分散于5mL Tris-Gly-8M Urea緩沖液中，漩渦振蕩后加入50μL 4mg/mL DTNB溶液，迅速混合后于室溫下保溫1h，以緩沖液代替樣品作空白對照，在412nm處比色，以13600M-1cm-1消光系數(shù)計(jì)算每mg蛋白質(zhì)游離巰基的摩爾數(shù)。

1.2.6 粒徑的測定 采用Nano-ZS馬爾文納米粒度分布儀測定樣品的粒徑分布。用0.01mol/L的磷酸緩沖液（pH7.0）配制0.02%的蛋白質(zhì)溶液，過0.45μm的水膜進(jìn)行測量。

1.2.7 表面疏水性的測定 采用ANS熒光探針法測定蛋白質(zhì)表面疏水性[10]。用0.01mol/L的磷酸緩沖液（pH7.0）配制不同濃度的蛋白質(zhì)溶液（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和0.1%）和8mmol/L的1-苯胺基-8-萘磺酸（ANS）溶液。取20μL ANS溶液加到5mL蛋白質(zhì)溶液中，混合均勻，迅速測定混合液的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長和吸收波長分別是390nm和470nm。以蛋白質(zhì)濃度對熒光強(qiáng)度作圖，采用最小二乘法進(jìn)行曲線擬合，直線的斜率即為蛋白質(zhì)的H0。

1.2.8 內(nèi)源熒光光譜的測定 采用熒光分光光度計(jì)測定樣品的內(nèi)源熒光光譜[11]。用0.01mol/L的磷酸緩沖液（pH7.0）配制0.2mg/mL蛋白質(zhì)溶液，過0.45μm的水膜進(jìn)行測量。熒光發(fā)散光譜分析以蛋白質(zhì)內(nèi)部熒光基團(tuán)為探針，熒光光譜在290nm激發(fā)，掃描波長為300～400nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5nm，電壓為500mV。

1.2.9 溶解度的測定 用去離子水配制5mg/mL的樣品溶液，充分?jǐn)嚢韬箅x心（10000×g，20min），上清液中的蛋白質(zhì)采用雙縮脲法[12]測定，利用牛血清白蛋白（BSA）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定540nm處的吸光值。根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)含量和溶液中蛋白質(zhì)含量比值計(jì)算溶解度。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)均為3次測定的平均值，使用Excel 2007作圖，并用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化對花生分離蛋白羰基值的影響

蛋白質(zhì)羰基值是廣泛用于評價(jià)蛋白質(zhì)氧化程度的指標(biāo)之一。Zamora等[13]的研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的氫過氧化物及其次生產(chǎn)物可與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)羰基含量的增加。由圖1可見，隨著反應(yīng)體系中底物亞油酸含量的增加，花生分離蛋白的羰基值從3.83nmol/mg增加到5.8nmol/mg（p＜0.05），隨后略微下降到5.35nmol/mg（p＜0.05）。羰基值的升高可能是因?yàn)橹狙鹾厦复呋瘉営退嵫趸a(chǎn)生的脂質(zhì)自由基可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)自由基的生成，在蛋白質(zhì)的α碳原子或其側(cè)鏈氨基酸殘基的其他碳原子上形成蛋白質(zhì)類過氧化物，從而引起蛋白質(zhì)羰基含量的增加[7]；而羰基值的下降可能是因?yàn)?號樣品的氧化程度較深，生成較多的不可溶性聚集體，使部分氧化反應(yīng)所形成的羰基因沉淀分離而未被檢測出來。該結(jié)果表明氧化使花生分離蛋白的氨基酸組成發(fā)生了變化，進(jìn)而對花生分離蛋白的構(gòu)象造成一定的影響。

2.2 氧化對花生分離蛋白游離巰基含量的影響

圖1 不同亞油酸含量對花生分離蛋白羰基值的影響Fig.1 Effect of different contents of linoleic acid on thecarbonyl content of PPI

巰基和二硫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的重要的化學(xué)鍵[14]，對蛋白質(zhì)的功能特性（如凝膠、起泡和乳化性能等）起著非常重要的決定作用。氧化可以改變半胱氨酸的氧化還原狀態(tài)以及巰基/二硫鍵交互反應(yīng)的平衡常數(shù)，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)分子中巰基和二硫鍵的含量和分布[15]。如圖2所示，隨著反應(yīng)體系中底物亞油酸含量的增加，花生分離蛋白的游離巰基含量不斷減少，從5.16nmol/mg下降到4.25nmol/mg（p＜0.05）。蛋白質(zhì)的變性、二硫鍵的生成均可導(dǎo)致游離巰基含量的下降。崔旭海等[16]的研究表明，巰基的降低可能是由于在多肽分子之間或多肽內(nèi)部形成二硫鍵，或者是進(jìn)一步氧化成磺酸類或其他氧化產(chǎn)物，從而導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)中巰基含量的下降。黃友如等[7]的研究表明，在添加亞油酸和脂肪氧合酶的大豆蛋白模擬體系中，巰基可能被氧化成非二硫鍵形式的基團(tuán)，從而造成蛋白質(zhì)中半胱氨酸的損失。

圖2 不同亞油酸含量對花生分離蛋白游離巰基含量的影響Fig.2 Effect of different contents of linoleic acid on the free sulphydryl content of PPI

2.3 氧化對花生分離蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性可以反映蛋白質(zhì)表面疏水性基團(tuán)的數(shù)量，它決定了蛋白質(zhì)分子間相互作用的能力，從而影響蛋白質(zhì)的功能特性[17]。如圖3所示，花生分離蛋白的表面疏水性隨著反應(yīng)體系中底物亞油酸含量的增加先從123.28升高至185.93（p＜0.05），再下降到99.35（p＜0.05）。這可能是由于花生分離蛋白的結(jié)構(gòu)隨著氧化程度的增加逐漸展開，分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)逐漸暴露，從而導(dǎo)致其表面疏水性的增加；當(dāng)氧化程度進(jìn)一步加深時(shí)，展開的蛋白質(zhì)分子又在疏水作用和二硫鍵的作用下重新聚集，使花生分離蛋白表面疏水性降低。該結(jié)果表明氧化改變了花生分離蛋白的分子構(gòu)象。

2.4 氧化對花生分離蛋白熒光光譜的影響

圖3 不同亞油酸含量對花生分離蛋白表面疏水性指數(shù)的影響Fig.3 Effect of different contents of linoleic acid on the surface hydrophobicity of PPI

圖4 不同亞油酸含量對花生分離蛋白內(nèi)源熒光掃描時(shí)的熒光峰位的影響Fig.4 Effect of different contents of linoleic acid on the λmaxof PPI monitored by intrinsic fluorescence spectra

花生分離蛋白在290nm處激發(fā)所得到的主要是色氨酸為發(fā)射基團(tuán)的熒光光譜，可反映色氨酸殘基的變化程度及其微環(huán)境的變化情況[18]。如圖4所示，隨著反應(yīng)體系中底物亞油酸含量的增加，花生分離蛋白的熒光峰位λmax先從328.9nm逐漸增加到330.6nm（p＜0.05），再逐漸減小到328.7nm（p＜0.05）。λmax的紅移表明氧化使花生分離蛋白的結(jié)構(gòu)展開，分子內(nèi)部的色氨酸殘基逐漸暴露，而λmax的藍(lán)移則表明進(jìn)一步的氧化使花生分離蛋白重新發(fā)生聚集，分子中的色氨酸殘基暴露程度降低，被轉(zhuǎn)移到內(nèi)部非極性環(huán)境中。其熒光峰位λmax的分析結(jié)果與表面疏水性的分析結(jié)果相一致，進(jìn)一步表明氧化會(huì)導(dǎo)致花生分離蛋白的聚集和結(jié)構(gòu)的變化。

2.5 氧化對花生分離蛋白聚集程度的影響

激光納米粒度測定儀只能對樣品的可溶性部分進(jìn)行測量，其測量結(jié)果一定程度上可以反映花生分離蛋白的聚集程度。不同氧化條件下花生分離蛋白的粒徑分布如圖5所示。與1號樣品相比，2號樣品的粒徑分布明顯向粒度小的方向偏移。隨著反應(yīng)體系中底物亞油酸含量的進(jìn)一步增加，3號和4號樣品的粒徑分布相似，均向粒度大的方向偏移，并十分接近1號樣品的粒徑分布。而5號樣品的粒徑分布又略微向粒度小的方向偏移。上述現(xiàn)象可能是由于氧化引起了花生分離蛋白的分子結(jié)構(gòu)展開，導(dǎo)致平均粒徑變??；再通過暴露的疏水基團(tuán)的相互作用生成可溶性聚集體，平均粒徑變大；并隨著進(jìn)一步的氧化最終生成不可溶性聚集體而使相應(yīng)的可溶性部分的平均粒徑有所降低。

圖5 不同亞油酸含量對花生分離蛋白粒徑分布的影響Fig.5 Effect of different contents of linoleic acid on the particle size distribution of PPI

溶解性是蛋白質(zhì)其他功能特性的基礎(chǔ)，溶解度也可以用來表征花生分離蛋白的聚集程度。本文參照牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7）計(jì)算各樣品的溶解度值。如圖6所示，2號樣品的溶解度略低于1號樣品的溶解度，二者相差1.14%（p＜0.05）。但隨著反應(yīng)體系中底物亞油酸含量的進(jìn)一步增加，3號樣品的溶解度達(dá)到最大值77.72%（p＜0.05），隨后溶解度逐漸下降到71.08%（p＜0.05）。該測定結(jié)果與粒徑分布的分析結(jié)果相結(jié)合，進(jìn)一步說明氧化會(huì)誘導(dǎo)花生分離蛋白聚集，并隨著氧化程度的加深，可溶性聚集體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄跃奂w。

圖6 不同亞油酸含量對花生分離蛋白溶解度的影響Fig.6 Effect of different contents of linoleic acid on the solubility of PPI

圖7 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The standard curve of bovine serum albumin

3 結(jié)論

脂肪氧合酶催化亞油酸氧化會(huì)對花生分離蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的影響。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，花生分離蛋白的氧化伴隨著羰基值的增加和游離巰基含量的下降。隨著反應(yīng)體系中底物亞油酸含量的增加，花生分離蛋白的表面疏水性和內(nèi)源熒光光譜的熒光峰位λmax均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，表明花生分離蛋白三級結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。此外，花生分離蛋白的粒徑分布和溶解度的變化規(guī)律表明氧化可誘導(dǎo)花生分離蛋白聚集，并隨著氧化程度的加深，可溶性聚集體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄跃奂w。

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Effect of oxidation on the structure of peanut protein isolate induced by lipoxygenase-catalyzed linoleic acid

LIAO Yu，YE Lin，ZHAO Mou-ming，SUN Wei-zheng*
（College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China）

Peanut protein isolate（PPI）was oxidized by free radicals and reactive oxidation products released by lipoxygenase-catalyzed linoleic acid.Carbonyl content，free sulphydryl content，particle size distribution，surface hydrophobicity，solubility and intrinsic fluorescence were determined to evaluate effect of oxidation on the structure of PPI.Results showed that，with increasing content of linoleic acid，the carbonyl content first increased then slightly decreased，the free sulfhydryl content decreased，and the surface hydrophobicity first increased then decreased，which reflected change in the structure of PPI after oxidation.Changes in the particle size distribution and solubility indicated the condition of PPI aggregates，and difference in the maximum emission wavelength indicated change of the tertiary conformation of PPI.All these showed that lipid oxidation could induce protein aggregation，leading to significant change in the structure of PPI.

peanut protein isolate；lipoxygenase；oxidation；structure

TS201.2

A

1002-0306（2014）04-0118-05

2013－07－17 *通訊聯(lián)系人

廖鈺（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品工程。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102201）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD37B08）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171783）。