不同大豆原料形成蛋白纖維聚合物的比較

董世榮，徐紅華，郭珊珊，高育哲，鞠婷婷

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

不同大豆原料形成蛋白纖維聚合物的比較

董世榮，徐紅華*，郭珊珊，高育哲，鞠婷婷

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

4種通過不同加工處理得到的大豆蛋白，在低pH條件下90℃加熱10h所形成的聚合物形態(tài)存在很大不同。利用硫磺素T（Th T）熒光強(qiáng)度、差量掃描儀（DSC）和SDS-PAGE凝膠電泳分析了來自不同原料大豆蛋白的聚合動力學(xué)和組成差異。結(jié)果表明，4種大豆原料因其加工工藝不同，蛋白質(zhì)組成存在差異，在本實驗的條件下，11S的存在尤其是堿性亞基會抑制纖維聚合物的形成。此外，離子強(qiáng)度也是纖維形成的一個必要條件。

纖維，聚合物，大豆蛋白，聚合動力學(xué)

食品蛋白質(zhì)通過熱聚合形成的聚合物對其功能性質(zhì)有很大改善，并在食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用，許多研究也主要集中在蛋白質(zhì)的聚合能力和聚合程度的控制方面，但這種聚合主要是在中性或高于等電點(diǎn)的介質(zhì)環(huán)境中完成的。近些年，低于等電點(diǎn)形成的纖維狀蛋白質(zhì)聚合物引起了人們的關(guān)注，如：乳清蛋白、β-乳球蛋白等可食用動物性蛋白質(zhì)可以在pH2.0附近形成直徑在幾納米的纖維聚合物，這種纖維聚合物可以明顯改變蛋白質(zhì)的粘性和凝膠特性[1-2]；很多植物蛋白質(zhì)在低pH條件下通過熱處理也同樣可以形成纖維聚合物，如：燕麥蛋白[3]、蕓豆蛋白[4]等。Kkermans等研究發(fā)現(xiàn)7S和大豆分離蛋白在pH2.0、85℃長時間加熱可以形成纖維[5]；Tang等研究發(fā)現(xiàn)7S在pH2.0、80℃長時間加熱也可以形成纖維[6]；隨后Wang等將7S的亞基α′、α和β-亞基分離出來，在pH2.0、85℃加熱可以形成不同形態(tài)的纖維聚合物[7]。針對目前的研究現(xiàn)狀，本文選用了3種成本低廉的市售大豆產(chǎn)品為原料，以自制的未經(jīng)過熱處理的大豆蛋白為對照，利用文獻(xiàn)提供的常規(guī)方法制備大豆蛋白纖維，希望通過比較不同原料在形成纖維方面的差異，為現(xiàn)有大豆產(chǎn)品拓展新的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3種原料 哈爾濱高科技有限公司：大豆分離蛋白SPIA（蛋白質(zhì)80.75%，灰分0.185%），大豆分離蛋白SPIG（蛋白質(zhì)89.69%，灰分0.1196%），低溫脫脂豆粕粉TZ（蛋白質(zhì)49.44%，灰分0.1144%）；自制原料ZZ利用組織搗碎機(jī)將大豆磨碎，過60目篩，按照國標(biāo)G2906-82進(jìn)行脫脂，樣品自然干燥得到自制脫脂豆粉（蛋白質(zhì)49.44%，灰分0.0891%）。

DS-1型高速組織搗碎機(jī) 上海精科實業(yè)有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī) 上海精密儀器研究所；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡 日本日立F-7650；硫磺素T（Th T） 美國Sigma-Aldrich公司；F-4500型熒光分光光譜儀 日本HITACHI；PE Pyris差示掃描量熱儀 美國PE公司；DTT-6C型電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆蛋白纖維的制備 參考Akkermans等[5]的方法并加以改進(jìn)，確定了大豆蛋白纖維的制備方法如下：將原料溶于去離子水中，將pH調(diào)制2.0（2mol/L HCl和0.1mol/L HCl），15000×g離心20min（20℃），取上清液，利用凱氏定氮法測定蛋白含量，用去離子水稀釋，使蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為10mg/mL，再次調(diào)整pH至2.0（2mol/L HCl和0.1mol/L HCl），90℃水浴10h，立即冷卻，4℃冰箱保存過夜。4種原料的大豆蛋白在制備纖維的過程中，所有的步驟均保持一致。

1.2.2 透射電鏡（TEM） 參考Mark等[8]的方法，使用透射電子顯微鏡（TEM）（放大2×104倍）測定樣品的微觀結(jié)構(gòu)。將熱處理后的大豆蛋白樣用去離子水稀釋成質(zhì)量濃度為3mg/mL，取一滴稀釋液滴于透射電鏡專用銅網(wǎng)上吸附15min，多余的部分用濾紙移除，室溫下干燥10min，采用80kV電壓下用透射電鏡進(jìn)行分析。

1.2.3 Th T熒光分析 將8mg Th T溶于10mL磷酸緩沖溶液（0.01mol/L，pH7.0，0.15mol/L NaCl）中制得Th T儲藏液[9]。充分溶解后用0.2μm的針頭過濾器濾除不溶Th T。Th T儲藏液用金屬箔于4℃的冰箱中密封避光保存，保存期不超過一周。實驗前，將儲藏液用相同的磷酸緩沖液稀釋50倍后制得工作液[10-11]。將120μL待測樣品于10mL Th T工作液混合，振蕩混勻后反應(yīng)1min后進(jìn)行測量。將儀器的激發(fā)波長設(shè)定在460nm，發(fā)射波長在490nm，激發(fā)波長狹縫為10nm，發(fā)射波長的狹縫間隙為5nm[12]，測定其熒光強(qiáng)度。

1.2.4 聚合動力學(xué) 采用Morris等[13]的經(jīng)驗公式，在Th T熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)擬合的式（1）中，ft是在加熱t(yī)時間時的熒光強(qiáng)度值，α、β和γ是常數(shù)。

tlag是成核期，t1/2max是熒光強(qiáng)度值增大到最大值一半的時間；（df/dt）max是熒光強(qiáng)度增大的最大速率[14]。

1.2.5 DSC的測定[15]DSC的測定是通過差量掃描儀進(jìn)行測定。根據(jù)具體實驗條件如下：起始溫度：20℃，保持1min；終止溫度：180℃，保持1min；升溫速度：10℃/min；冷卻物質(zhì)：液氮；降溫速度：30℃/min；取樣品5mg于專用的液體鋁盒內(nèi)，進(jìn)行實驗。

1.2.6 SDS-PAG凝膠電泳[16]將4種原料配制成溶液15000×g離心20min處理后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分析4種原料的組分差異。根據(jù)Laemml等方法加以改進(jìn)，實驗中分離膠質(zhì)量濃度為12%、濃縮膠質(zhì)量濃度為5%（w/v）。將4種原料溶液（蛋白質(zhì)量濃度為1.0%（w/v）用緩沖液（10mmol/L Tris/HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0）稀釋5倍之后，取20μL該稀釋液和20μL的0.1%（w/v）的溴酚藍(lán)充分混合，取5μL該混合液上樣，濃縮膠采用的電壓為60V，分離膠采用的電壓為90V，最后用0.1%（w/v）的考馬斯亮藍(lán)染色。通過電泳分析4種原料的組成成分的差異。

1.2.7 統(tǒng)計分析 每次實驗重復(fù)3次。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Statistix 8.1進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合物形態(tài)差異

4種不同大豆原料（SPIA、SPIG、TZ和ZZ）在90℃加熱處理10h形成的聚合物形態(tài)如圖1所示。SPIA可以形成細(xì)而長的淀粉樣纖維（圖1a）；SPIG的聚合物形態(tài)是帶有枝杈狀的團(tuán)簇聚合物（圖1b）；TZ形成了棉絮狀的聚合物（圖1c）；ZZ原料形成聚合物的形態(tài)為粗而長的無規(guī)則聚合物（圖1d）。結(jié)果表明，從不同原料中獲取的大豆蛋白，在相同的處理條件下，形成的聚合物形態(tài)存在很大不同，聚合物形態(tài)的差異可能與原料前期處理條件的不同有關(guān)。

圖1 不同大豆原料在低pH條件下聚合物的形態(tài)差異Fig.1 The morphologies of different soy proteins aggregates at low pH

2.2 聚合動力學(xué)

圖2 不同大豆原料熱處理過程中Th T熒光強(qiáng)度的變化Fig.2 Thioflavin T（Th T）fluorescence of diferent soy materials during heating times

纖維的形成主要分為3個時期：成核期、增長期和穩(wěn)定期，熱處理過程中Th T熒光強(qiáng)度的變化可以反映纖維聚合物的聚合狀態(tài)，同時，根據(jù)式（1）可以擬合出相應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)[17]。從圖2和表1所示的結(jié)果中可以看出，不同原料存在很大差異，與其他3種原料相比，SPIA原料的Th T結(jié)果最高，fmax高出SPIG原料137.07%和TZ原料49.53%，并且，加熱過程中SPIA的（df/dt）max值也要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他3種原料。說明SPIA的纖維聚合速率和聚合量都遠(yuǎn)高于其他3種原料，而未經(jīng)過任何熱處理的自制原料并未表現(xiàn)出益于纖維形成的趨勢，因此，不同原料的聚合方式與前期不同的處理過程可能存在一定的關(guān)系，大豆蛋白的組成和變性程度可能與纖維的形成存在一定關(guān)系。

表1 不同大豆原料的蛋白質(zhì)聚合動力學(xué)參數(shù)Table.1 Protein aggregates kinetic parameters of different soy materials

2.3 DSC

為了比較不同大豆原料中蛋白質(zhì)的變性程度，我們研究了4種原料變性溫度和焓變值。從表2的結(jié)果可以看出，4種原料之間的變性溫度和焓變值存在差異。相關(guān)文獻(xiàn)報道，7S和11S的變性溫度分別在70℃和90℃左右[18]。SPIA和SPIG的變性溫度主要集中在7S的變性溫度，而TZ和ZZ原料則存在7S和11S兩個變性溫度，這可能是因為SPIA、SPIG經(jīng)過了堿溶酸沉等工藝處理，使得11S的含量降低，而TZ和ZZ經(jīng)過加工處理較為簡單，11S的含量損失較少。電鏡的結(jié)果顯示SPIA可以形成纖維，這與文獻(xiàn)中報道的7S比11S更具有纖維化的潛力相一致[6]。從焓變值的結(jié)果可以看出，經(jīng)過越復(fù)雜工藝處理7S焓值越小，蛋白質(zhì)的適度變性有可能有利于纖維狀聚合物的形成。

表2 熱處理前后不同大豆原料的DSC結(jié)果Table.2 The results of DSC for different soy materials for heating and unheating treatment

2.4 蛋白質(zhì)組成

圖3 不同大豆原料蛋白質(zhì)組成差異Fig.3 The protein composition from different soy materials

從圖3的結(jié)果可以看出，4種原料的組分存在很大差異，SPIA和SPIG與TZ和ZZ相比缺少11S的堿性亞基，同時，7S的β-亞基也有所減少。這可能是因為SPIA和SPIG兩種原料經(jīng)歷了堿溶酸沉等過程，使得11S的堿性亞基減少甚至消失，在加工熱處理過程中7S的β-亞基也有部分的損失[18]。從電鏡、Th T熒光強(qiáng)度都顯示SPIA可以形成纖維，而TZ、ZZ不能形成纖維，11S的堿性亞基的存在有可能不利于纖維的形成。從電泳圖可以看出SPIG和SPIA的成分基本相同，但是SPIG沒有形成纖維聚合物，二者的差異主要來自溶液中的離子強(qiáng)度，SPIA和SPIG兩種原料pH2.0溶液的凍干粉的灰分分別為0.185%和0.119%，從圖3中可以看出，SPIA的鹽離子強(qiáng)度要大于SPIG的鹽離子強(qiáng)度。Wang等研究發(fā)現(xiàn)增大離子強(qiáng)度可以加速纖維“構(gòu)筑單位”的形成；Luben等[19]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)離子強(qiáng)度大于13mol/L時，β-乳球蛋白才可以形成纖維，這些研究結(jié)果與本研究的結(jié)果都充分說明鹽離子強(qiáng)度也是大豆蛋白纖維形成的一個必要條件。

3 結(jié)論

不同加工處理的大豆原料在低pH條件下，蛋白質(zhì)的熱聚合物形態(tài)存在很大差異。4種蛋白質(zhì)形成纖維聚合物的能力不同，SPIA的最大熒光強(qiáng)度高出SPIG原料137.07%和TZ原料49.53%，SPIA的聚合速率分別是TZ的62倍和SPIG的41倍。這種差異與蛋白質(zhì)組成有關(guān)，11S尤其是堿性亞基的存在可能一定程度上抑制纖維聚合物的形成。同時，在大豆蛋白組成相同的條件下，離子強(qiáng)度也是纖維形成的一個必要條件。

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Comparison of fibril aggregates from different soy materials

DONG Shi-rong，XU Hong-hua*，GUO Shan-shan，GAO Yu-zhe，JU Ting-ting
（College of Food of Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

The aggregates of four kinds of soy protein from different production processes were formed with the different morphologies at low pH and heating at 90℃ for 10h.Thioflavin T（Th T）fluorescence，differential scanning calorimeter（DSC），and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）were used to monitor the kinetics of aggregation and the protein compositions.The results indicated that protein compositions were remarkably different due to the different production processes.The glycinin（11S），especially basic subunits inhibited the formation of fibril aggregates under the test condition.In addition，ionic strength played an important role in the formation of fibril aggregates.

fibril；aggregate；soy protein；kinetics of aggregation

TS201.2

A

1002-0306（2014）04-0114-04

2013－07－08 *通訊聯(lián)系人

董世榮（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品蛋白質(zhì)。

國家自然基金項目（31071572）；黑龍江省教育廳青年學(xué)術(shù)骨干項目（1155G10）；黑龍江省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)計劃項目（2010td11）。