基質固相分散-高效液相色譜法同時測定冬蟲夏草和蛹蟲草中的9種核苷及堿基

王志兵，張洪玉，劉 洋，方志勇，陳思蓉，李 碩

（長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春130012）

基質固相分散-高效液相色譜法同時測定冬蟲夏草和蛹蟲草中的9種核苷及堿基

王志兵，張洪玉，劉 洋，方志勇，陳思蓉，李 碩

（長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春130012）

目的：建立基質固相分散-高效液相色譜法（MSPD-HPLC）同時測定野生冬蟲夏草、深層發(fā)酵培養(yǎng)的蛹蟲草菌絲體和固態(tài)培養(yǎng)的蛹蟲草子實體中的腺嘌呤、腺苷、胸腺嘧啶、胸苷、尿嘧啶、尿苷、胞嘧啶、鳥苷和蟲草素。方法：采用MSPD-HPLC法同時測定上述9種核苷及堿基。結果：MSPD提取條件為：弗羅里硅土為分散劑，分散劑與樣品質量比為4∶1，15mL石油醚為淋洗劑，15mL甲醇為洗脫劑。標準曲線在線性范圍內具有較好的線性關系（r＞0.9997），化合物的檢出限和定量限分別為12.4～79.4ng·mL-1和41.2～264.6ng·mL-1。日內和日間精密度均低于7.28%。樣品加標回收率在81.54%～95.77%之間。結論：本法簡單快速，樣品用量少，可廣泛應用于中草藥和生物藥品中核苷和堿基的同時測定。

基質固相分散，核苷類物質，冬蟲夏草，蛹蟲草子實體，蛹蟲草菌絲體，高效液相色譜

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.）作為我國傳統(tǒng)名貴中藥，含有蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸和SOD[1-2]等多種活性成分，常用于治療盜汗、高血糖、高血脂、腎衰竭、心律不齊、心臟病和肝炎等多種疾病[3-5]。由于野生冬蟲夏草稀缺、價格昂貴，許多研究者致力于尋找冬蟲夏草的替代品。目前，人們通過深層發(fā)酵培養(yǎng)和固態(tài)培養(yǎng)技術獲得了大量蛹蟲草（Cordyceps militaris）菌絲體和子實體[6-7]。然而在市場上卻出現(xiàn)了許多假冬蟲夏草及其偽劣替代品。據(jù)相關報道，冬蟲夏草中最重要的活性成分是核苷類物質及其堿基，它們已被廣泛用作冬蟲夏草及其替代品的質控指標[8-9]。因此，建立一種用于同時測定冬蟲夏草和蛹蟲草中核苷類成分的檢測方法是極其重要的。

目前，冬蟲夏草中核苷類物質的測定方法有液相色譜-質譜聯(lián)用（LC-MS）、毛細管電泳（CE）、離子對反相分配色譜（IP-RPC）、毛細管電色譜（CEC）和高效液相色譜法（HPLC）[2，4-5，7-8，10-16]。樣品前處理方法有溶劑萃取法、回流提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、高壓液相提取、超臨界流體萃取和固相萃取等方法[12，14]。該類方法雖然可獲得較高的提取率，但卻耗時、費力，并且需要大量的樣品和溶劑。基質固相分散法（Matrix solid-phase dispersion，MSPD）是由美國Barker教授等首次提出的一種類似于固相提取的樣品預處理方法[17]，此法高效、快速、操作簡便，且集提取、凈化、分離于一身，現(xiàn)已被廣泛應用于動物、蔬菜、水果等食品中藥物殘留和植物中化學成分的提取等方面[18-21]。因此，本研究首次將基質固相分散提取技術與高效液相色譜法相結合用于冬蟲夏草及其替代品中的核苷類物質的測定，并對影響基質固相分散的提取條件進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生冬蟲夏草（樣品1） 購于吉林大藥房；液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的蛹蟲草菌絲體（樣品2） 由實驗室自制；人工培養(yǎng)的蛹蟲草子實體（樣品3） 購于長白山特產有限公司，分別將上述三種樣品在60℃的烘箱中干燥后粉碎，過40目篩，備用；標準品腺嘌呤、腺苷、胸腺嘧啶、胸苷、尿嘧啶、尿苷、胞嘧啶、鳥苷和蟲草素 美國Sigma公司，純度均大于99%；色譜級甲醇 美國Fisher公司；其余試劑 均為分析級，購買于北京化工廠；超純水 由Milli-Q水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）制得；硅膠、活性炭、硅藻土、弗羅里硅土、酸性氧化鋁、中性氧化鋁和堿性氧化鋁 購于中國藥品生物制品檢定所。

LC-20AB高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測器 日本島津；PinnacleⅡC18色譜柱 5μm，4.6mm× 250mm，美國瑞斯泰克；KQ-100DE超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司；RE-52C旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮。

1.2 貯備液的制備

將腺嘌呤、腺苷、胸腺嘧啶、胸苷、尿嘧啶、尿苷、胞嘧啶、鳥苷和蟲草素分別溶解在含90%甲醇的水溶液中，獲得500μg·mL-1的標準儲備液，工作溶液是由標準儲備液經(jīng)甲醇稀釋得到的。

1.3 基質固相分散提取[17-21]

準確稱取0.050g樣品，并按比例再準確稱取一定質量分散劑于瑪瑙研缽中，混合均勻后研磨5min，然后將混合物轉移到底部有一層脫脂棉的自制玻璃柱中，并在混合物的頂部放一層脫脂棉，用玻璃棒壓實。先用15mL淋洗劑淋洗樣品混合物，棄去淋洗液，再用15mL洗脫劑洗脫，收集洗脫液于25mL蒸餾燒瓶中，在40℃下旋蒸至干，用500μL甲醇回溶，溶解液過0.22μm濾膜，進行HPLC分析。

1.4 色譜條件

流動相：0.1%乙酸水溶液（A）-甲醇（B）。梯度洗脫條件為：0～8min，5%B；8～13min，5%～10%B；13～13.5min，10%～15%B；13.5～17.5min，15%～18%B；17.5～23min，18%～24%B；23～34min，24%B；34～39min，5%B。流速：0.5mL·min-1；進樣量：5μL；柱溫：25℃。紫外檢測波長：254nm。

1.5 提取率的計算

式中，C：樣品提取液中目標化合物的濃度，μg· mL-1；V：樣品提取液的體積，mL；m：樣品質量，g。

1.6 基質固相分散提取條件的確定

為了獲得最佳的提取率，本文考察了影響基質固相分散的提取條件，即分散劑的種類、分散劑與樣品質量比、淋洗劑種類及體積、洗脫劑種類及體積。所有實驗平行操作三次。

1.6.1 分散劑的種類和樣品與分散劑的質量比 為了找到最合適的分散劑，本實驗考察了硅膠、弗羅里硅土、酸性氧化鋁、中性氧化鋁和堿性氧化鋁樣品提取率的影響。并分析了弗羅里硅土和樣品的質量比（1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1）對提取率的影響。

1.6.2 淋洗劑的種類和體積 研究了正己烷、石油醚、二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯作為淋洗劑對目標化合物的淋洗效果。并考察了當樣品用量為0.050g，分散劑質量為0.20g時，淋洗劑體積（5、10、15、20、25mL）對目標化合物提取率的影響。

1.6.3 洗脫劑的種類和體積 本實驗考察了甲醇、乙腈、乙醇和丙酮4種洗脫劑對核苷類化合物的洗脫能力，并考察了洗脫劑的體積（5、10、15、20、25mL）對目標化合物提取率的影響。

1.6.4 凈化劑的影響 為了進一步去除洗脫液中的少量雜質，在MSPD提取過程中，將0.2g不同種類的凈化劑（活性炭、氧化鋁、硅藻土和硅膠）分別裝入MSPD玻璃柱底部，以研究凈化劑對洗脫液的凈化效果。

2 結果與討論

2.1 標準品色譜圖

標準品色譜圖如圖1所示。尿嘧啶，尿苷，胸苷，胞苷，腺嘌呤，鳥苷，胸腺嘧啶，腺苷和蟲草素與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在1.10～1.20，理論塔板數(shù)以各色譜峰計均在5000以上。

圖1 標準品色譜圖Fig.1 Chromatograms of the standard solution

2.2 基質固相分散提取條件的確定

2.2.1 分散劑的種類和樣品與分散劑的質量比 分散劑的種類是MSPD提取中一個重要的參數(shù)。在MSPD過程中，分散劑不僅作為吸附分離材料，而且還是分散樣品的載體。實驗結果如圖2所示，當使用3種氧化鋁作為分散劑時，目標化合物的提取率均低于其他分散劑；使用弗羅里硅土和硅膠作為分散劑時，目標化合物的提取率最高。然而，弗羅里硅土比硅膠更容易研磨和轉移。因此，本實驗選擇弗羅里硅土為分散劑。

圖2 分散劑種類對提取率的影響Fig.2 Effect of the type of dispersant on the extraction yields

從圖3可以看出，質量比對化合物提取率的影響并不明顯，考慮到當質量比為4∶1時，化合物的提取率比其他比例時稍高。因此，本實驗選擇弗羅里硅土與樣品質量比為4∶1。

圖3 分散劑與樣品質量比對提取率的影響Fig.3 Effect of the ratio of dispersant to sample on the extraction yields

2.2.2 淋洗劑的種類和體積 為了去除樣品中的油脂和少量雜質，在樣品洗脫之前要先用非極性溶劑淋洗MSPD柱。淋洗劑的使用不僅能獲得干凈的、無干擾的色譜圖，還能在旋蒸過程中獲得完全干燥的提取物，從而減少目標化合物的損失。實驗結果表明，以石油醚作為淋洗劑時，目標化合物可獲得更高的提取率，結果見圖4。

圖4 淋洗劑種類對提取率的影響Fig.4 Effect of the type of washing solvent on the extraction yields

實驗結果如圖5所示，當石油醚的體積從5mL增加到15mL時，腺苷、尿嘧啶、尿苷、胞苷、胸苷和蟲草素的提取率略有增加，當體積從15mL增加到25mL時，提取率基本不變。然而，隨著石油醚體積的不斷增加，腺嘌呤和胸腺嘧啶的提取率基本沒有變化。因此，本實驗選擇石油醚用量為15mL。

圖5 淋洗劑體積對提取率的影響Fig.5 Effect of volume of washing solvent on the extraction yields

2.2.3 洗脫劑的種類和體積 由于核苷類物質為極性物質，易溶于極性有機溶劑，而難溶于非極性溶劑。實驗結果表明，洗脫溶劑的選擇對目標化合物的萃取效果有很大影響，且強極性的甲醇對目標化合物的洗脫能力明顯優(yōu)于乙腈、乙醇和丙酮，9種目標化合物的回收率均較高。因此，本實驗選擇甲醇作為基質固相分散的洗脫劑。洗脫劑的體積對目標化合物提取率的影響結果見圖6，當洗脫劑體積從5mL增加到15mL時，核苷和堿基的提取率稍有增加，而當洗脫劑的體積從15mL增加到25mL時，化合物提取率趨于平穩(wěn)。所以，選擇甲醇體積為15mL。

圖6 洗脫劑體積對提取率的影響Fig.6 Effect of volume of elution solvent on the extraction yields

2.2.4 凈化劑的影響 實驗結果表明，當使用氧化鋁作為凈化劑時，雖然色譜圖較干凈，干擾峰較少，但化合物回收率也隨之降低；當使用其他凈化劑時，所獲得的色譜圖與無凈化劑時相比并沒有明顯的區(qū)別。所以，本實驗未使用凈化劑。

2.3 方法驗證

2.3.1 線性關系 配制含有9種目標化合物的混合標準品儲備液，并稀釋到合適的濃度，在最佳色譜條件下，檢測不同濃度化合物的峰面積，然后用峰面積（A）對分析物濃度（C）作圖，繪制標準曲線，得到線性回歸方程。各化合物在0.11～385.00μg·mL-1范圍內有很好的線性關系，相關系數(shù)r＞0.9997。詳細結果見表1。

2.3.2 檢出限和定量限 檢出限（LOD）和定量限（LOQ）是信噪比（S/N）分別為3和10時實驗方法所能檢出和定量的目標化合物的最低濃度。9種核苷和堿基的檢出限和定量限見表1。

2.3.3 適用性和精密度 為了評價該法的適用性和精密度，本實驗分析3種不同種類的蟲草樣品（即野生冬蟲夏草、深層發(fā)酵培養(yǎng)蛹蟲草菌絲體和人工固體培養(yǎng)蛹蟲草子實體）中的9種核苷和堿基。實驗結果表明（見表2），樣品中尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、胞苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷和蟲草素的含量分別是40.52～179.95、261.73～548.61、8.75～82.63、18.61～956.70、42.11～134.79、81.76～241.03、12.06～33.93、241.99～267.85、0～3419.78μg·g-1。從表2可以看出，尿苷、鳥苷和腺苷是野生冬蟲夏草、人工培養(yǎng)蛹蟲草菌絲體和子實體中的主要化合物，這與先前的報道是一致的[1，6，8]。而且，人工培養(yǎng)的蛹蟲草子實體和菌絲體中的核苷及堿基含量并不相同，這可能與培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)方式、生長條件和采摘時期等因素有關。另外，與蛹蟲草子實體和菌絲體相比，野生冬蟲夏草中的胸腺嘧啶、胞苷和蟲草素含量較低，尤其是蟲草素，富含于人工培養(yǎng)的蛹蟲草子實體中，而在野生冬蟲夏草中很少能檢測到。3種樣品提取物的色譜圖見圖7。

精密度采用相對標準偏差（RSD）來表示。日內精密度是一天內連續(xù)分析六次樣品得到的，日間精密度是每天分析兩次，連續(xù)分析三天得到的。日內和日間精密度RSD列于表2中。結果表明，核苷和堿基的日內和日間精密度RSD分別是1.19%～5.07%和2.12%～7.28%。

2.3.4 回收率 為了分析該法的準確度，本實驗研究了加標樣品的回收率。加標樣品是向樣品中添加混合標準品溶液得到的。為了保證標準溶液能均勻的分散于樣品中，加標時需加入適量甲醇，直到樣品粉末被甲醇完全浸沒為止，小心混勻后于室溫下自然干燥24h。將混合物按本法進行提取和分析。9種化合物的回收率列于表3中，其相對標準偏差均低于6.56%。

3 結論

本研究將基質固相分散提取法與高效液相色譜檢測技術相結合，建立一種用于冬蟲夏草及其替代品中核苷和堿基的分析方法。本法簡單快速，樣品用量少，各化合物的檢出限和定量限分別為12.4～79.4ng·mL-1和41.2～264.6ng·mL-1，加標樣品回收率在81.54%～95.77%之間。本法測定結果令人滿意，可被廣泛應用于中草藥和生物藥品中核苷和堿基的同時測定。

表1 各目標化合物的線性方程，相關系數(shù)，檢出限和定量限Table.1 Linear regression data，limit of detection（LOD），limit of quantification（LOQ）of target compounds

表2 化合物的提取率和精密度Table.2 Extraction yields and precision for the analytes

圖7 樣品提取物的色譜圖Fig.7 Chromatograms of the extracts

表3 化合物的回收率Table.3 Recoveries of the analytes

[1]王征，劉建利.冬蟲夏草化學成分研究進展[J].中草藥，2009，40（7）：1157-1160.

[2]張虹，吳雪美.高效液相色譜-質譜聯(lián)用法分析冬蟲夏草及其功能食品中的活性成分[J].中國食品學報，2007，7（5）：113-120.

[3]Das S K，Masuda M，Sakurai A，et al.Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris：Current state and prospects[J]. Fitoterapia，2010，81（8）：961-968.

[4]Yang F Q，Guan J，Li S P.Fast simultaneous determination of 14 nucleosides and nucleobases in cultured Cordyceps using ultra-performance liquid chromatography[J].Talanta，2007，73（2）：269-273.

[5]Xie J W，Huang L F，Hu W，et al.Analysis of the Main Nucleosides in Cordyceps Sinensis by LC/ESI-MS[J].Molecules，2010（15）：305-314.

[6]楊昕，斯陸勤，涂秩平，等.不同產地人工蛹蟲草子實體及冬蟲夏草中核苷類成分的比較[J].醫(yī)藥導報，2009，28（10）：1354-1356.

[7]黃蘭芳，郭方遒，梁逸曾，等.HPLC-ESI-MS測定冬蟲夏草和蠶蛹蟲草中腺苷和蟲草素含量[J].中國中藥雜志，2004，29（8）：762-764.

[8]梁洪卉，程舟，楊曉伶，等.HPLC定量分析冬蟲夏草的主要核苷類有效成分[J].中藥材，2008，31（1）：58-60.

[9]范志華，湯衛(wèi)華，林霖.HPLC法測定冬蟲夏草發(fā)酵菌絲粉中腺苷的含量[J].現(xiàn)代食品科技，2007，23（7）：94-97.

[10]于榮敏，葉斌，宋麗艷.人工培養(yǎng)蛹蟲草高效液相色譜指紋圖譜的初步研究[J].中草藥，2007，38（9）：1403-1405.

[11]張博，楊黎彬，李金娟.高效液相色譜法測定蟲草菌粉中腺苷的含量[J].光譜實驗室，2011，28（2）：899-901.

[12]Li S P，Li P，Lai C M，et al.Simultaneous determination of ergosterol，nucleosides and their bases from natural and cultured Cordyceps by pressurised liquid extraction and high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A，2004，1036（2）：239-243.

[13]Guo F Q，Li A，Huang L F，et al.Identification and determination of nucleosides in Cordyceps sinensis and its substitutes by high performance liquid chromatography with mass spectrometric detection[J].J Pharm Biomed Anal，2006，40（3）：623-630.

[14]Fan H，Li S P，Xiang J J，et al.Qualitative and quantitative determination of nucleosides，bases and their analogues in natural and cultured Cordyceps by pressurized liquid extraction and high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry（HPLC-ESI-MS/MS）[J].Anal Chim Acta，2006，567（2）：218-228.

[15]Huang L F，Liang Y Z，Guo F Q，et al.Simultaneous separation and determination of active components in Cordyceps sinensis and Cordyceps militarris by LC/ESI-MS[J].J Pharm Biomed Anal，2003，33（5）：1155-1162.

[16]Yang F Q，Ge L，Yong J H，et al.Determination of nucleosides and nucleobases in different species of Cordyceps by capillary electrophoresis-mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2009，50（3）：307-314.

[17]Barker S A.Applications of matrix solid-phase dispersion in food analysis[J].J Chromatogr A，2000，880（1-2）：63-68.

[18]王重洋，王遠鵬，王寧，等.基質固相分散-超快速液相色譜法測定牛肉中磺胺類獸藥[J].分析化學，2013，41（1）：83-87.

[19]胡秋芬，郭紅，周元清，等.基質固相分散-高效液相色譜法測定蟲草中甘露醇[J].理化檢驗-化學分冊，2008，44（10）：940-944.

[20]Enríquez-Gabeiras L，Gallego A，Garcinu?o R M，et al. Interference-free determination of illegal dyes in sauces and condiments by matrix solid phase dispersion（MSPD）and liquid chromatography（HPLC-DAD）[J].Food Chem，2012，135（1）：193-198.

[21]Shi X L，Jin Y R，Liu J B，et al.Matrix solid phase dispersion extraction of ginsenosides in the leaves of Panax ginseng[J].Food Chem，2011，129（3）：1253-1257.

Simultaneous determination of nine nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis and Cordyceps militarris by matrix solid-phase dispersion coupled with high performance liquid chromatography

WANG Zhi-bing，ZHANG Hong-Yu，LIU Yang，F(xiàn)ANG Zhi-yong，CHEN Si-rong，LI Shuo
（College of Chemistry and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012，China）

Objective：To develop a matrix solid-phase dispersion（MSPD）-high performance liquid chromatography（HPLC）for simultaneous determination of uracil，adenine，thymine，uridine，adenosine，thymidine，cytidine，guanosine and cordycepin in natural Cordyceps sinensis，cultured Cordyceps militarris mycelia and Cordyceps militarris fruiting bodies.Methods：Nine nucleosides and nucleobases were extracted by MSPD and determined by HPLC.Results：The experimental conditions for the MSPD were optimized.Florisil was used as dispersant，petroleum ether as washing solvent and methanol as elution solvent.The ratio of Florisil to sample was selected to be 4∶1.The calibration curve had good linear relationship（r＞0.9997）.The limits of detection and quantification were in the range of 12.4～79.4ng·mL-1and 41.2～264.6ng·mL-1，respectively.Intra-and interday precision were lower than 7.28%.The recoveries were between 81.54%and 95.77%.Conclusion：The present method was simple，and consumed less sample.The present MSPD-HPLC method should be applied for simultaneous extraction of nucleosides and nucleobases in herbal materials，pharmaceutical products and biological drugs.

matrix solid-phase dispersion extraction（MSPD）；nucleoside compounds；Cordyceps sinensis；Cordycepsmilitarris fruitingbodies；Cordycepsmilitarris mycelia；high-performanceliquidchromatography（HPLC）

TS207.3

A

1002-0306（2014）04-0083-06

2013－05－21

王志兵（1982-），男，博士，講師，研究方向：中藥與食品分析。

吉林省醫(yī)藥產業(yè)發(fā)展專項資金（YYZX201130-2）。