TaqMan實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)豬腦心肌炎病毒方法的建立與應(yīng)用

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（上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

TaqMan實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)豬腦心肌炎病毒方法的建立與應(yīng)用

張強(qiáng)，王巧全，熊煒，李樹(shù)清，李健，林穎崢，黃忠榮

（上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

針對(duì)豬腦心肌炎病毒（EMCV）基因組保守區(qū)域，設(shè)計(jì)并合成了特異性引物和TaqMan探針，建立了EMCV的TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR方法。通過(guò)常規(guī)RT-PCR方法擴(kuò)增EMCV保守序列并將其連入pMD19-T載體，制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，優(yōu)化反應(yīng)條件，以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，EMCV標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999。結(jié)果顯示，該方法檢測(cè)靈敏度達(dá)到10拷貝/μL，對(duì)豬捷申病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、乙型腦炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性。方法重復(fù)性好，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2%。檢測(cè)采集自上海供港豬場(chǎng)、進(jìn)境美國(guó)種豬、加拿大、法國(guó)種豬的血清樣本145份，EMCV核酸的檢出率國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)53.6%，美國(guó)豬檢出率為27.6%，加拿大豬檢出率為20%，法國(guó)豬檢出率為26.7%。EMCV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的建立為該病的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效手段。

豬腦心肌炎病毒；實(shí)時(shí)熒光 PCR；TaqMan探針

腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）是一種重要的共患病病原，可以引起豬及某些哺乳動(dòng)物乃至靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的一種以腦炎、心肌炎或心肌周?chē)诪橹饕卣鞯募毙詡魅静　?958年，巴拿馬首次報(bào)道EMCV能夠感染豬并引起豬急性致死性心肌炎[1]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)EMCV與豬的繁殖障礙也有關(guān)聯(lián)[2]?，F(xiàn)在世界上主要養(yǎng)豬國(guó)家都有該病流行的報(bào)道[3]。我國(guó)于2005年首次從病死仔豬和流產(chǎn)胎兒中分離到EMCV[4]，證實(shí)國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)存在該病。規(guī)?；i場(chǎng)血清學(xué)調(diào)查表明，我國(guó)豬場(chǎng)普遍感染EMCV，血清抗體陽(yáng)性率很高[5]，豬腦心肌炎已成為危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要隱患。

EMCV感染很常見(jiàn)，但臨床癥狀卻很少見(jiàn)，常呈亞臨床狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)口感染仔豬，接種6小時(shí)即可在腸道檢測(cè)到病毒；接種后3天，可在肝臟、腎臟、脾臟和肺臟分離到病毒[6]。因此，在EMCV隱性感染和感染早期診斷該病具有重要意義。獵人及動(dòng)物園獸醫(yī)雖可感染EMCV，并產(chǎn)生特異性抗體[7-8]，但其公共衛(wèi)生影響并未受到重視。近年隨著異種器官移植的興起，豬作為人類(lèi)器官移植的重要供體動(dòng)物，EMCV對(duì)人類(lèi)健康的隱患受到越來(lái)越多的關(guān)注[9]。因此，亟待建立敏感、特異、快速的檢測(cè)方法來(lái)診斷該病。本研究采用Taqman探針技術(shù)，建立了EMCV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，為EMCV快速診斷提供了有效的技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 血樣和毒株 檢測(cè)血樣采集自上海郊區(qū)某豬場(chǎng)，從美國(guó)、加拿大和法國(guó)引進(jìn)的種豬；豬腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）、豬捷申病毒（porcine teschovirus，PTV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑和儀器 Ex Taq DNA聚合酶、Premix Ex Taq （Probe qPCR）、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs、DNA Marker、pMD19-T載體等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司；RNA提取試劑盒（Cat No.74106）購(gòu)自Qiagen有限公司。主要儀器為ABI ViiA 7熒光定量PCR儀。

1.3 引物和探針 應(yīng)用BioEdit 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離毒株及GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的EMCV基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)， 利用Beacon Designer軟件在EMCV基因組保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物和TaqMan 熒光探針。 探針的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM， 3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為T(mén)AMRA。EMCVFP：5’-GGGATCAGCTTTTACGGCTTT-3’，EMCVRP：5’-CCCATGCATCCGATAGAGAAC-3’，EMCV Probe：5’（FAM）CGATGCCAACGAGGACGCCC（TAMRA）3’， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為95bp。 另外， 針對(duì)EMCV保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)常規(guī)RT-PCR引物用于制備陽(yáng)性質(zhì)粒， 引物序列為EMCVF：5'-CATTGAGACAAATCCAGGGCC-3'，EMCVR：5'- ATCTGCTCAAGAGCTGCTTCC-3’，產(chǎn)物286bp。 引物和探針由英維捷基（上海）公司合成。

1.4 病毒基因組RNA的提取 按照Qiagen公司RNeasy Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病料組織中的病毒基因組RNA。

1.5 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備 以EMCVF和EMCVR為引物，擴(kuò)增EMCV基因保守序列區(qū)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為280bp。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。膠回收目的片段，連入pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和序列測(cè)定，獲得測(cè)序完全正確的質(zhì)粒pMDEMCV作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，質(zhì)粒用NanoDrop（Thermo Scientifc）微量分光光度計(jì)測(cè)量OD260，根據(jù)公式計(jì)算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。質(zhì)粒-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用無(wú)RNA酶水對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)模板，優(yōu)化引物和探針的濃度、Tm值及反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，計(jì)算Ct值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用建立起來(lái)的熒光定量RTPCR方法對(duì)PTV、PRRSV、CSFV、JEV、TGEV進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.8 敏感性試驗(yàn) 用107拷貝/μL陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做熒光定量PCR，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取3份病毒含量不同的樣品進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。

1.10 病料的檢測(cè) 應(yīng)用建立起來(lái)的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)145份采自上海郊區(qū)某豬場(chǎng)從美國(guó)、加拿大、法國(guó)引進(jìn)的種豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

以提取的細(xì)胞毒總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%濃度瓊脂糖凝膠電泳后，可見(jiàn)約280bp的基因片段，與預(yù)期基因片段的大小相一致（圖1）?；厥赵撃康幕蚱?，將其連入pMD19-T載體，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增獲得的目的基因片段與毒株已知序列同源性為100%，可用作標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度為1.88×1010拷貝/uL。

圖1 EMCV基因的RT-PCR擴(kuò)增

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將pMDEMCV質(zhì)粒經(jīng)10倍系列稀釋至1.88×103～1.88×107拷貝/μL共5個(gè)濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品做3個(gè)重復(fù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL， 包括2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）10μL，上、下游引物（10 pmol/ L）各0.8μL，探針（10 pmol/L）0.8μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，模板（質(zhì)?；騝DNA）2μL，DEPC 水5.2μL 。反應(yīng)條件為：95℃變性 40s；以95℃變性20 s，56℃退火延伸25 s， 45個(gè)循環(huán)擴(kuò)增；在56℃采集熒光。結(jié)果pMDEMCV的各濃度均有很好的線性關(guān)系，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，其相關(guān)系數(shù)R2=0.999， 擴(kuò)增效率E=98.11%（圖 2 a 和b）。

2.3 敏感性與特異性試驗(yàn)

將陽(yáng)性質(zhì)粒pMDEMCV按照101-1012梯度稀釋作為模板，進(jìn)行TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR 檢測(cè)， 最低檢出量為10 拷貝/μL（圖3）。以對(duì)照病毒PTV、PRRSV、CSFV、JEV、TGEV和EMCV用建立起來(lái)的熒光定量RT-PCR做檢測(cè)，結(jié)果顯示針對(duì)EMCV的檢測(cè)方法檢測(cè)PTV、PRRSV、CSFV、JEV、TGEV均為陰性（圖4），說(shuō)明本方法特異性很好。

圖2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EMCV的動(dòng)力學(xué)曲線（a）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（b）

圖3 Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EMCV的敏感性試驗(yàn)

圖4 Taqman實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)EMCV的特異性試驗(yàn)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)含量不同的3份EMCV感染樣品做5個(gè)批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)，變異系數(shù)均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好（表1）。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)EMCV批內(nèi)及批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)

2.6 臨床樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，檢測(cè)采集自上海郊區(qū)某豬場(chǎng)，從美國(guó)、加拿大、法國(guó)引進(jìn)種豬的血清樣本共計(jì)145份，結(jié)果顯示供港豬場(chǎng)樣品30份陽(yáng)性（30/56），美國(guó)種豬8份樣品陽(yáng)性（8/29），加拿大種豬6份陽(yáng)性（6/30），法國(guó)種豬8份陽(yáng)性（8/30）（表2）。

表2 應(yīng)用熒光定量RT-PCR 檢測(cè)豬血清樣品中EMCV 的結(jié)果

3 討論

目前， EMCV的分子檢測(cè)方法主要有普通PCR和實(shí)時(shí)（Real-time）PCR。Real-time PCR秉承及發(fā)展了普通PCR的快速、高靈敏度檢出等全部?jī)?yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了普通PCR不能準(zhǔn)確定量、容易污染等不足，可以說(shuō)Real-time PCR使PCR技術(shù)發(fā)生了質(zhì)的飛躍，擴(kuò)展了PCR技術(shù)的應(yīng)用范疇，逐漸成為動(dòng)物疫病診斷的主要方法。Real-time PCR是通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的，其熒光檢出方法可分為熒光嵌入法（SYBR Green I）和熒光探針?lè)▋煞N。由于SYBR Green I定量PCR體系中使用的SYBR Green I染料非特異性結(jié)合雙鏈DNA，染料分子除了與特異性的靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合外，還能與反應(yīng)體系中的引物二聚體、污染的基因組DNA、PCR擴(kuò)增過(guò)程中形成的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。特異性強(qiáng)是熒光探針?lè)o(wú)可替代的優(yōu)點(diǎn)。

本研究建立了針對(duì)EMCV的基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法，通過(guò)特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)檢驗(yàn)，結(jié)果表明，該方法均具有較高的敏感性，最低可檢測(cè)到10 拷貝/μL 的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品；特異性強(qiáng)，對(duì)EMCV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，但對(duì)其他常見(jiàn)豬源病毒PTV、PRRSV、CSFV、JEV、TGEV的檢測(cè)結(jié)果均為陰性；重復(fù)性好，對(duì)含有EMCV的3份病毒樣品進(jìn)行5 個(gè)批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗(yàn)，變異系數(shù)均小于2%。應(yīng)用建立的TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，檢測(cè)采集自上海郊區(qū)豬場(chǎng)，美國(guó)、加拿大、法國(guó)進(jìn)境種豬血清樣本共計(jì)145份，共檢出52份陽(yáng)性樣品，證明該方法可靠。EMCV Taqman實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的建立，為EMCV快速診斷及EMCV準(zhǔn)確定量提供了有效的技術(shù)平臺(tái)。

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Development and Application of Taqman Real-time RT- PCR Assay for Detection of Porcine Encephalomyocarditis Virus

Zhang Qiang， Wang Qiaoquan， Xiong Wei， Li Shuqing， Li Jian， Lin Yingzheng， Huang Zhongrong（Shanghai Entry-Exit Inspection and Qarantine Bureau，Shanghai，200135）

A Taqman real-time fuorescence quantitative PCR was established using primers and probe based on the conserved region of encephalomyocarditis virus（EMCV） genomes. The amplifcation sequence of EMCV was cloned into the pMD19-T vector and a series of diluted recombinant plasmid was used to generate standard curves. The real-time quantitative PCR assay could detect as less as 10 copies of target cDNA of EMCV. The assay showed good specifcity with negative reactions for other porcine viruses（PTV，PRRSV，CSFV，JEV and TGEV）. The variation coeffcient of intra-batch or inter-batch was below 2%，indicating good reproducibility. 145 serum samples of pigs from domestic farms and USA，Canada，F(xiàn)rance were detected by the real-time PCR，and the results showed that 53.6%，27.6%，20%and 26.7% of the sample were positive for EMCV respectively. The method can be used for EMCV infection investigation.

encephalomyocarditis virus； real-time fuorescence quantitative PCR； Taqman probe

S852.659.5； S858.23

：A

：1005-944X（2014）05-0081-04

上海檢驗(yàn)檢疫局科技項(xiàng)目（HK012-2010）