黃柄曲霉ASD菌株抑菌譜測定及抑菌物質(zhì)初探

謝小平 劉長遠(yuǎn) 趙奎華 王 輝 關(guān)天舒 梁春浩 賈 姝 張 里

（1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧沈陽110866；2 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，遼寧沈陽110161）

辣椒疫?。≒hytophthora capsiciLeonian）是北方設(shè)施辣椒生產(chǎn)上的重要土傳病害，在防治上主要以化學(xué)防治為主，因化學(xué)防治存在農(nóng)藥殘留問題，因此，生物菌劑研究已逐漸成為防治辣椒疫病的熱點(diǎn)。黃柄曲霉（Aspergillus flavipes）屬于曲霉屬，研究發(fā)現(xiàn)黃柄曲霉對植物病害真菌有較好的抑制作用。李淑彬等（2001）從大亞灣海底沉積物中分離出1株具有廣譜抗真菌作用的黃柄曲霉，對辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、新月彎孢霉（Curvularia lunata）、棉炭疽菌（Colletotrichum gossypii）等多種植物病原真菌有強(qiáng)烈抑制作用。王輝等（2012）研究表明黃柄曲霉ASD菌株對辣椒疫病有較好的防治效果，其防效優(yōu)于化學(xué)藥劑代森錳鋅和烯酰嗎啉，但對抑菌物質(zhì)種類和結(jié)構(gòu)未作深入研究。本試驗(yàn)以黃柄曲霉ASD菌株為研究對象，主要開展了抑菌譜測定和抑菌物質(zhì)的提取，以期為該菌株生防菌劑研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 黃柄曲霉ASD菌株，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所園藝作物病害研究室提供。

1.1.2 供試病原菌 辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）、黃瓜蔓枯病菌（Mycosphaerella melonis）、甜瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae）、黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinereaPers.）、梨輪紋病菌（Physalospora piricolaNose）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、茄子根腐病菌（Fusarium solani），均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所園藝作物病害研究室提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉12 g，蒸餾水1 000 mL。

PD 培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 ASD菌株抑菌譜的測定 采用對峙培養(yǎng)法（Getha & Vikineswary，2002），在直徑為9 cm 的PDA 平板上相距2.5 cm 的位置放置直徑為0.6 cm的ASD菌餅及供試病原菌菌餅，于25℃培養(yǎng)4 d，測量抑菌帶寬度。

1.2.2 ASD菌株的發(fā)酵培養(yǎng) ASD菌株在PDA 平板上27℃培養(yǎng)5 d后，取菌體接種于裝有100 mL PD 培養(yǎng)液的250 mL 三角瓶中，27℃、150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)5d（王輝，2012）。

1.2.3 ASD菌株發(fā)酵液的制備 發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵原液，12 000 r·min-1離心30 min，取上清液用微孔濾膜去除菌體，即為ASD菌株的發(fā)酵液（Ji et al.，2007），采用牛津杯法檢測其抑菌活性。

1.2.4 硫酸銨分段鹽析條件確定 取發(fā)酵液用不同飽和度的硫酸銨（10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%）分級沉淀，4℃靜止過夜后，12 000 r·min-1離心30 min 棄上清液，分別收集每一個(gè)飽和度的沉淀物（陳雪麗 等，2006）。沉淀物用少量體積的0.01 mol·L-1磷酸緩沖液（PBS）（pH 7.2）溶解，裝入透析袋中，用雙蒸水透析去鹽并用聚乙二醇6000 包埋濃縮后即得到抑菌物質(zhì)粗提物。

1.2.5 抑菌活性的測定 采用含毒介質(zhì)法（全鑫 等，2010；唐琳和趙輝，2011）檢測抑菌物質(zhì)粗提物的抑菌活性。將抑菌物質(zhì)粗提物與PDA 培養(yǎng)基按照1∶10的比例混合倒平板，以PDA 培養(yǎng)基作為對照，在平板的中心放置1個(gè)辣椒疫病菌菌餅，3次重復(fù)，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，觀察辣椒疫病菌的生長情況。

1.2.6 蛋白酶對抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響 取50%硫酸銨飽和度提取的抑菌物質(zhì)粗提物與按1∶1∶1的比例混合的胰蛋白酶、蛋白酶 K 和蛋白酶E 發(fā)生反應(yīng)，蛋白酶濃度為1 mg·mL-1，在恒溫 37℃下反應(yīng) 1 h（高小寧，2012）。采用含毒介質(zhì)法檢測經(jīng)酶解后抑菌物質(zhì)粗提物的抑菌活性，以辣椒疫病菌為指示菌，每處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃柄曲霉ASD菌株抑菌譜測定

由表1可知，黃柄曲霉ASD菌株對辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌、甜瓜蔓枯病菌、黃瓜蔓枯病菌、黃瓜炭疽病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄灰霉病菌、梨輪紋病菌、小麥赤霉病菌、茄子根腐病菌均有抑制作用，抑菌譜較廣，其抑菌帶的寬度為2.9～11.8 mm，其中對辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌有較強(qiáng)的抑制作用（圖1）。

表1 黃柄曲霉ASD菌株的抑菌譜及抑菌帶寬度

圖1 黃柄曲霉ASD菌株對辣椒疫病菌和番茄晚疫病菌的抑制效果

2.2 黃柄曲霉ASD菌株發(fā)酵液的抑菌活性檢測

從平板抑菌活性試驗(yàn)可以看出，黃柄曲霉ASD菌株的發(fā)酵液對辣椒疫病菌有很強(qiáng)的抑菌活性，ASD菌株200 μL 發(fā)酵液對辣椒疫病菌的抑菌帶寬度為7.4 mm（圖2）。

圖2 黃柄曲霉ASD菌株發(fā)酵液對辣椒疫病菌的抑菌活性

2.3 黃柄曲霉ASD菌株抑菌物質(zhì)粗提物對辣椒疫病菌的抑制作用

試驗(yàn)結(jié)果顯示（表2），經(jīng)10%～90%飽和硫酸銨沉淀后的抑菌物質(zhì)粗提物對辣椒疫病菌均有抑制活性，其中經(jīng)50%飽和硫酸銨沉淀后的抑菌物質(zhì)對辣椒疫病菌的抑制活性最強(qiáng)（圖3），抑制效果達(dá)到80.78%。由此說明，經(jīng)50%飽和硫酸銨沉淀的物質(zhì)是具有抑菌效果的抑菌物質(zhì)。

表2 經(jīng)不同飽和度硫酸銨沉淀后的ASD菌株抑菌物質(zhì)粗提物對辣椒疫病菌的抑制作用

圖3 經(jīng)50%硫酸銨飽和度沉淀的抑菌物質(zhì)對辣椒疫病菌的抑菌效果

2.4 黃柄曲霉ASD菌株抑菌物質(zhì)粗提物經(jīng)酶解后對辣椒疫病的抑制作用

抑菌活性檢測結(jié)果表明，50%硫酸銨飽和度沉淀的抑菌物質(zhì)粗提物經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶 K 和蛋白酶 E處理后，對辣椒疫病菌幾乎無抑制作用，由此說明，經(jīng)50%硫酸銨飽和度沉淀提取的抑菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

黃柄曲霉ASD菌株是從土壤中分離得到的，該菌對辣椒疫病具有較好的防治效果。本試驗(yàn)結(jié)果表明黃柄曲霉ASD菌株對多種植物病原真菌有不同程度的抑制作用，特別對辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌有較強(qiáng)的抑制作用，采用硫酸銨分級沉淀的方法可得到黃柄曲霉ASD菌株的抑菌物質(zhì)粗提物，50%硫酸銨飽和度沉淀出的抑菌物質(zhì)粗提物對辣椒疫病菌的抑制活性最強(qiáng)，抑菌效果達(dá)到80.78%，并確定其為蛋白類物質(zhì)。

黃柄曲霉是一種分布廣泛的土壤真菌，在防治植物病害方面報(bào)道較少。該菌在代謝過程中能夠產(chǎn)生細(xì)胞壁水解酶，抑制一些病原真菌生長（郭雷 等，2013）。蔣亭等（2002）從黃柄曲霉中分離得到7種化合物，大部分有抑菌活性；李淑彬等（2001）從海底沉積物中分離得到的黃柄曲霉可產(chǎn)生一種廣譜抗真菌抗生素179M。本試驗(yàn)通過對ASD菌株抑菌物質(zhì)的初步研究，明確了其具有潛在的植物病害生物防治價(jià)值。

陳雪麗，郝再彬，王光華，金劍，劉居?xùn)|.2006.多粘類芽孢桿菌BRF-1 抗菌蛋白的分離純化.中國生物防治，23（2）：156-159.

高小寧.2012.植物內(nèi)生細(xì)菌菌株Em7 對油菜菌核病的防治研究〔博士論文〕.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué).

郭雷，朱文成，劉瑋煒，丁國偉，張?jiān)角?，張守祿，邱月，謝宇.2013.抗菌活性海洋真菌HN4-13 的鑒定及其發(fā)酵優(yōu)化.微生物學(xué)通報(bào)，（6）：38-45.

李淑彬，王軍，楊勁松，鐘英長，周世寧，林永成.2001.抗真菌抗生素179M 產(chǎn)生菌的分離鑒定和生理特性研究.菌物系統(tǒng)，20（3）：362-367.

蔣亭，田黎，李果，付宏征，林文翰.2002.黃?？缴婢鶤spergillus flavipes化學(xué)成分的研究.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，18（1）：19-21.

全鑫，薛保國，楊麗榮，孫虎，閆海霞.2010.生防菌株YB-81 的鑒定及其對番茄灰霉病的防效.植物保護(hù)，36（5）：57-60.

唐琳，趙輝.2011.茄子黃萎病拮抗生防木霉菌的篩選.北方園藝，（16）：60-62.

王輝.2012.辣椒疫病生防ASD菌株篩選及對土壤微生態(tài)調(diào)控機(jī)理研究〔博士論文〕.沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué).

王輝，劉長遠(yuǎn)，趙奎華，孫軍德.2012.一株抗辣椒疫病真菌的篩選及鑒定.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，34（2）：152-156.

Getha K，Vikineswary S.2002.Antagonistic effects ofStreptomyces violaceusnigerstrain G10 onFusarium oxysporumf.sp.cubenserace 4，indirect evidence for the role of antibiosis in the antagonistic process.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，28：303-310.

Ji Z Q，Wang M A，Zhang J W，Wei S P，Wu W J.2007.Two new members of streptothricin class antibiotics fromStreptomyces qinlingensissp.nov.The Journal of Antibiotics，60（12）：739-744.