L-異亮氨酸高產(chǎn)菌種的選育研究

謝飛，崔國英，王翀，江兵，沈聯(lián)兵，虞龍

（1.宜昌三峽制藥有限公司，湖北宜昌443000；2.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211186）

L-異亮氨酸高產(chǎn)菌種的選育研究

謝飛1，崔國英1，王翀1，江兵1，沈聯(lián)兵1，虞龍2

（1.宜昌三峽制藥有限公司，湖北宜昌443000；2.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211186）

以谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）為出發(fā)菌株，利用低能氮離子束注入對其進行多次誘變，結(jié)合異亮氨酸氧肟酸鹽（IleHx）等氨基酸結(jié)構(gòu)類似物定向篩選，得到一株穩(wěn)定的高產(chǎn)L-異亮氨酸菌株：搖瓶培養(yǎng)72 h，產(chǎn)酸可達21～22 g/L，在50 L發(fā)酵罐上發(fā)酵51 h，產(chǎn)酸可達32 g/L。

L-異亮氨酸；離子束注入；誘變

L-異亮氨酸（L-isoleucine，L-Ile）是人體8種必需氨基酸之一，也是3種支鏈氨基酸之一，因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能，在人類生命代謝中具有特別重要的地位[1]。食品方面主要用于食品強化，提高食品的營養(yǎng)價值。醫(yī)藥方面，3種支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸）組成的復(fù)合氨基酸輸液，對治療腦昏迷、肝昏迷、腎病等具有顯著療效，并可取代糖代謝提供能量[2-3]。

目前，國內(nèi)從事L-異亮氨酸生產(chǎn)的企業(yè)不少，如河南味之素氨基酸公司、無錫晶海氨基酸公司、南寧贏創(chuàng)美詩藥業(yè)有限公司、山東魯洲氨基酸有限公司、湖北八峰藥化有限公司、山東阜豐發(fā)酵有限公司、宜昌三峽制藥有限公司等，其中味之素公司的發(fā)酵水平領(lǐng)先，為35 g/L左右。而L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株的選育是提高發(fā)酵生產(chǎn)能力的關(guān)鍵。

作為一種遺傳改良新方法，離子束誘變育種具有能量沉積、動量傳遞、粒子注入和電荷交換等4個原初反應(yīng)過程，其作用機制相當(dāng)復(fù)雜[4-5]。離子束誘變的起因不僅是由于能量沉積引起的DNA單雙鏈斷裂，并且還通過離子注入過程中質(zhì)、能、電多因子作用使遺傳物質(zhì)分子原子發(fā)生移位和重組，且其突變性狀具有多發(fā)性和重復(fù)性的特點[6-7]。

本研究利用低能氮離子（N+）注入改良發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸的谷氨酸棒狀桿菌，篩選出1株高產(chǎn)菌株，使發(fā)酵水平有了一定程度的提高。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum），宜昌三峽制藥有限公司保藏菌種。

篩選斜面培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉3g/L，異亮氨酸氧肟酸鹽40g/L，瓊脂20g/L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25～35 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，玉米漿20～30 g/L，碳酸鈣10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖120～150 g/L，硫酸銨25～40 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，玉米漿20～30 g/L，碳酸鈣25～30 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

LZD900多功能離子注入機：核工業(yè)西南物理研究院研制；721G分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；pHS-25型精密pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SBA-40系列生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；Ultimate3000液相色譜儀：美國戴安公司；ZHY-2112B雙層特大容量全溫度恒溫搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司；FUS-50L（A）發(fā)酵罐：上海國強生化工程裝備有限公司。

1.3 低能離子注入工藝與樣品處理

用5 mL無菌水洗脫新鮮斜面（培養(yǎng)24 h），振蕩，制成一定濃度的菌懸液。取0.1 mL菌懸液均勻涂布于無菌空培養(yǎng)皿上，用無菌風(fēng)吹干后進行N＋注入。離子注入機為LZD900多功能離子注入機，使用以20keVN＋、不同劑量進行注入，靶室真空度為10-3Pa。N＋注入后取出平皿，以1 mL無菌水洗脫，涂篩選平板培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)2～3 d用于單菌落的挑選。

1.4 篩選方法

將平板篩選獲得的變異株接1環(huán)于裝有12.5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)72 h，用紙層析法分離，比色法測定發(fā)酵液中的L-異亮氨酸。根據(jù)單位體積發(fā)酵液中異亮氨酸的產(chǎn)量確定高產(chǎn)菌株。

1.5 分析方法

發(fā)酵液中殘?zhí)牵翰捎肧BA-40系列生物傳感分析儀測定。

OD值：稀釋25～50倍后，在波長562 nm處用分光光度計測定。

L-異亮氨酸含量：初步測定采用紙層析——分光光度計定量法測定[8]；準確測定采用液相色譜測定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 存活率曲線

N+注入谷氨酸棒狀桿菌的存活率曲線見圖1。從圖1可知，谷氨酸棒狀桿菌的存活率符合“馬鞍型”劑量—效應(yīng)曲線[10]，即存活率先減少再增加，然后減少。

圖1 N+注入谷氨酸棒狀桿菌的存活率Fig.1 Survival rate ofCorynebacterium glutamicumimplanted by N+

由于誘變機理復(fù)雜，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是：低劑量時離子只對細胞表面進行損傷，因而存活率較高；隨著注入劑量的增加，細胞表面刻蝕嚴重，離子進入細胞內(nèi)部并產(chǎn)生大量自由基和軟射線等，使存活率急劇下降，但下降到一定值時，細胞某種修復(fù)機制被激活，使得存活率有所回升；當(dāng)劑量增加到一定時，細胞損傷已無法修復(fù)，存活率再次下降[11]。

2.2 菌種篩選

從平板篩選出來的菌株，經(jīng)種子瓶轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中逐個發(fā)酵，測定L-異亮氨酸含量。同時與出發(fā)菌株對照計算突變率，挑取高產(chǎn)菌株進一步發(fā)酵驗證。得到的高產(chǎn)菌株，經(jīng)遺傳穩(wěn)定驗證后，進行下一步誘變篩選。采用能量20 keV的N+，以30×1013～210×1013N+/cm2為處理劑量對菌株進行誘變篩選，結(jié)果見圖2。

圖2 N+注入谷氨酸棒狀桿菌的突變率Fig.2 Mutation rate ofCorynebacterium glutamicumimplanted by N+

由圖2可知，以150×1013N+/cm2為最佳處理劑量，該處總突變率較高，且正突變率高于負突變率，表明以該劑量進行離子注入可獲得較多的正突變菌株，有助于篩選工作的進行。經(jīng)過多輪篩選，獲得1株高產(chǎn)突變菌株，將菌株實際發(fā)酵水平提高到22 g/L。為驗證高產(chǎn)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，對這些菌株進行了連續(xù)5代的傳代試驗和發(fā)酵能力的考察，結(jié)果見表1。

表1 高產(chǎn)突變株遺傳穩(wěn)定性試驗Table 1 Genetic stability of high-yield mutant strain

表1結(jié)果表明，所得到的這些高產(chǎn)菌株在5代仍保持較高的發(fā)酵能力，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.3 發(fā)酵罐小試驗證

雖然搖瓶篩選中溫度和轉(zhuǎn)速的控制比較準確，但發(fā)酵過程的pH控制比較粗放，且溶氧、殘?zhí)撬揭搽y以保證菌種處于最佳水平。為了驗證菌種在發(fā)酵罐上的生產(chǎn)水平，利用50L自動控制發(fā)酵罐進行試驗，可克服搖瓶的不足，檢驗菌種在實際應(yīng)用中的生產(chǎn)能力。

50 L罐分批發(fā)酵過程中殘?zhí)恰a(chǎn)酸和OD562nm監(jiān)測結(jié)果見圖3。

圖3 50L罐分批發(fā)酵過程趨勢曲線-1(殘?zhí)?、產(chǎn)酸和OD562nm的變化)Fig.3 Batch fermentation curve-1 in 50-liters fermentor(change of residual sugar,acid production,OD562nm)

由圖3可知，發(fā)酵前期，菌體以生長為主，葡萄糖消耗的速度比較快，此期間菌體生長代謝中產(chǎn)生的L-異亮氨酸主要用于自身合成；進入發(fā)酵中期，通過控制殘?zhí)菨舛仍谝欢ㄋ剑偈咕w代謝由生長向產(chǎn)物合成遷移，發(fā)酵液中L-異亮氨酸的含量逐步提高；到了發(fā)酵后期，菌體活力降低，OD562nm維持在一定水平。由于在菌種誘變時采用異亮氨酸氧肟酸鹽進行定向篩選，減少了產(chǎn)物的反饋抑制，因此發(fā)酵液中L-異亮氨酸的含量繼續(xù)增加，直至發(fā)酵結(jié)束[12-13]。該菌株產(chǎn)L-異亮氨酸水平為3.2%，即32g/L。

圖4 50L罐分批發(fā)酵過程趨勢曲線-2(耗氧速率、二氧化碳釋放率、溶氧、尾氣的變化)Fig.4 Batch fermentation curve-2 in 50-liters fermentor(change of OUR,CER,DO,tail gas)

分析圖4可知，發(fā)酵前期，菌體快速生長，耗氧速率（oxygen uptake rate，OUR）、二氧化碳釋放率（carbon dioxide evolution rate，CER）迅速上升，溶氧（dissolved oxygen，DO）下降明顯，因此尾氣中氧含量下降比較快；進入發(fā)酵中期，OUR、CER繼續(xù)升高，但CER上升速度更快，兩者呈“分叉”趨勢，表明菌體進入了碳源限制狀態(tài)[14]，開始利用培養(yǎng)基中的氨基酸作為碳源，微生物轉(zhuǎn)入初級代謝，此時DO需維持在一定范圍內(nèi)，促進并維持代謝流的這種變化。由于產(chǎn)物的合成產(chǎn)生CO2，尾氣中CO2值快速提升，并高于氧氣值，表明代謝強度逐漸升高；進入發(fā)酵后期，由于殘?zhí)菨舛冉档?，加之菌體活力下降，OUR、CER同步下降，同時尾氣中氧含量逐漸升高，表明代謝趨于結(jié)束[15-16]。

3 結(jié)論

通過運用離子注入技術(shù)誘變選育生產(chǎn)L-異亮氨酸的谷氨酸棒狀桿菌，建立N+注入誘變該菌的方法并總結(jié)了N+注入后生物學(xué)效應(yīng)規(guī)律。經(jīng)過多輪篩選得到1株高產(chǎn)突變株：與出發(fā)菌株相比，發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸的能力提高約10%左右，L-異亮氨酸的水平達到22 g/L左右，說明N+注入誘變技術(shù)對提高L-異亮氨酸發(fā)酵水平具有比較好的效果。通過在50 L發(fā)酵罐上進行小試，菌種產(chǎn)酸可達32 g/L。

本研究通過對原有L-異亮氨酸生產(chǎn)菌種進行誘變選育，提高了其發(fā)酵水平，同時也為該菌種日后的誘變提高奠定了基礎(chǔ)。

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Breeding of high L-isoleucine producing strains

XIE Fei1,CUI Guoying1,WANG Chong1,JIANG Bing1,SHEN Lianbing1,YU Long2
(1.Yichang Sanxia Pharmaceutical Co.,Ltd.,Yichang 443000,China;2.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology,Nanjing 211186,China)

UsingCorynebacterium glutamicumas original strain,through low energy N+implanting intoC.glutamicum,combining with isoleucine hydroxamic(IleHx)and other amino acid structure analogues to conduct directed screening,one high L-isoleucine yield mutant strain was obtained. After 72 h fermentation in shaking flask,the concentration of L-Ile was 21-22 g/L,and after 51 h fermentation in 50-liters fermentor,the concentration of L-Ile was 32 g/L.

L-Isoleucine;ion implantation;mutation

TQ922

A

0254-5071（2014）11-0098-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.022

2014-08-19

江蘇省高校自然科學(xué)研究計劃（03KJB180038）

謝飛（1982-），男，工程師，碩士，研究方向為工業(yè)微生物菌種誘變選育及小試研究。